论文摘要
目的肝纤维化（liver fibrosis）是各种慢性肝病产生的一种病理过程，可视为肝硬变的早期阶段。在我国慢性乙型肝炎是引起肝纤维化及肝硬化的主要原因。α-干扰素（interferonα，IFN-α）作为治疗病毒性肝炎的抗病毒药物应用于临床的同时，近年来一些学者研究发现α-干扰素还具有一定的不依赖于抗病毒作用而独立存在的抗肝纤维化的作用，但对其抗肝纤维化的作用机制仍不十分清楚。目前已有研究表明IFN-α有促进肝星状细胞（Hepatic stellate cell，HSC）凋亡的作用，但对其作用于凋亡的何阶段未见报道。本研究运用四甲基偶氮唑蓝实验（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）及应用流式细胞仪（flow cytometry）AnnexinV和PI双染方法研究在外源性α-干扰素的刺激下，体外培养的活化的大鼠HSC早期凋亡的情况，进一步认识α-干扰素抗肝纤维化的作用机制，为临床应用提供理论依据。材料与方法在本研究中，我们对活化的大鼠HSC进行体外培养，然后分别选取生长状态良好的不同的三代细胞，接种在96孔板中后，用含IFN-α浓度分别为0、1×102、1×103、1×104、1×105 U／ml的DMEM培养液与活化的大鼠HSC共同培养24小时后，向各孔加入MTT液50ul继续培养4小时后，弃上清液，加入二甲基亚砜（DMSO）100ul，震荡10min，上酶标仪于492nm波长处测吸光度值，代表各孔的细胞数。再选取生长状态良好的不同的三代细胞，分别加入含有与上述相同浓度的IFN-α的DMEM培养液与活化的大鼠HSC共同培养24小时后，取1ml细胞，1000rpm 4℃离心10分钟，弃上清。加入1ml冷的PBS，轻轻震荡使细胞悬浮，1000rpm，4℃离心10分钟，弃上清。将细胞悬于200ul Binding Buffer，加入10ulAnnexinV-FITC和5ul PI，轻轻混匀，避光室温反应15分钟，加入300ul Binding Buffer，在1小时内应用美国BD公司流式细胞仪进行检测。应用SPSS 11.0统计软件对以上结果进行t检验。实验结果α-干扰素对活化的大鼠HSC凋亡影响的研究。1.MTT法测定结果：用含IFN-α浓度分别为0、1×102、1×103、1×104、1×105U／ml的DMEM培养液与活化的大鼠HSC共同培养24小时后，测得各组的OD值分别为0.493±0.0518、0.4497±0.0338、0.4273±0.0566、0.3657±0.0581和0.2707±0.0387。以上结果可以看出，经IFN-α刺激后，活化的大鼠HSC的活细胞数随IFN-α的浓度增加而减少。经SPSS软件进行t检验统计学分析，1×104、1×105U／ml的IFN-α组与对照组比较有显著性差异，分别为t=2.82和t=5.44＞t0.05/2（4）=2.132，P＜0.05有统计学意义。而其他两组与对照组比较无显著差异。说明IFN-α在浓度为1×104、1×105U／ml时可使活化的大鼠HSC的数目减少，表明IFN-α可能有诱导活化的大鼠HSC凋亡的作用。2.流式细胞仪检测结果：用0、1×102、1×103、1×104及1×105 U／ml作用浓度组的IFN-α作用于体外培养的活化的HSC后，经Annexin V和PI双染上流式细胞仪检测结果IFN-α作用组的右下象限中的红色标记点比对照组的右下象限中红色标记点明显增多，并且1×104及1×105U／ml早期凋亡率分别为0.0553±0.008921、0.0915±0.0200。经SPSS软件进行统计学分析，1×104及1×105U／ml两个作用浓度组的早期凋亡率与对照组比较有显著性差异，分别为t=4.31和t=5.07＞t0.05/2（4），P＜0.05有统计学意义。说明IFN-α主要诱导活化的大鼠HSC的早期凋亡。结论1.IFN-α有诱导体外培养的活化大鼠HSC凋亡的作用。2.IFN-α诱导体外培养的活化大鼠HSC的凋亡主要是作用在凋亡的启始阶段，即促进体外培养的活化大鼠HSC的早期凋亡。