论文摘要
目的:探讨玻璃化冷冻保存对大鼠胰岛细胞的影响以及通过玻璃化冷冻保存的方法建立胰岛细胞库;且将二甲基亚砜、乙二醇与甲酰胺按照不同比例联合应用,观察其对大鼠胰岛细胞的影响。选取优化方案及对其可能机制探讨。方法:将分离纯化的的胰岛细胞制备为悬液,检测其纯度合格（＞60%）后。将悬液分为四组:A组为新鲜胰大鼠岛细胞组,作为对照组,观察经冷冻保存复温后的大鼠胰岛细胞相对新鲜组的变化。B组方案10%（V/V）DMSO+10%（V/V）乙二醇,C组方案10%（V/V）DMSO+10%（V/V）乙二醇+10%（V/V）甲酰胺,D组方案20%（V/V）DMSO+20%（V/V）乙二醇+10%（V/V）甲酰胺。将B、C、D组使用玻璃化冷冻方法保存,即将胰岛细胞与冷冻保护剂混匀后,直接投入液氮中保存,分别于7d、14d后在37℃快速复温。经不同浓度蔗糖液、Hanks液分级移出冷冻保护剂后,含10%（v/v）胎牛血清RPMI1640培养。置培养瓶于37℃、95%O2,5%CO2恒温培养箱中过夜培养。通过AO-PI染色,荧光显微镜下,通过计数染色细胞计算胰岛细胞的活率,间接反应胰岛细胞结构的完整性。采用ELISA方法检测胰岛素分泌情况,观察胰岛细胞的功能。综合二项指标评价玻璃化冷冻保存方法。结果:（1）胰岛细胞的纯度79.6%;（2）胰岛细胞活率的比较:B组、D组与A组比较P＜0.05,按照α=0.05检验水准,B组、D组与A组存在统计学差异。C组与A组比较P＞0.05,按照α=0.05检验水准,认为二组之间不存在统计学差异。C组内不同时间段比较P＞0.05,按照α=0.05检验水准,认为二者之间没有统计学差异;（3）胰岛素分泌量的比较:B组、D组与A组比较P＜0.05,按照α=0.05检验水准,B组、D组与A组存在差异。C组与A组比较P＞0.05,按照α=0.05检验水准,认为二组之间不存在统计学差异。C组内不同时间段比较P＞0.05,按照α=0.05检验水准,认为二者之间没有统计学差异。结论:通过直接投入液氮快速降温和37℃快速复温的手段,辅以适当配比的冷冻保护剂使用,玻璃化冷冻保存可以用于胰岛细胞的保存,为建立胰岛细胞库提供一种有效的方法。推动胰岛细胞移植进展,为糖尿病病人带来福音。