玉米寡肽转运蛋白基因（ZmOPT0212）的克隆及其表达分析

论文摘要

提高作物氮素利用效率对保障全球粮食安全起到举足轻重的作用,围绕作物氮素利用效率的研究已成为植物营养遗传学研究的热点。植物分子生理学研究结果显示,寡肽转运蛋白（OPT）参与了植物氮素吸收转运与利用,对植物氮利用效率提高有着显著的影响。本论文以我国第二大粮食作物玉米为研究对象,选用目前常规育种广泛使用的骨干自交系掖478及以其为背景的3个导入系IL8、IL26、IL65为试验材料,采用RT-PCR克隆玉米寡肽转运蛋白基因,并进行生物信息学分析,通过亚细胞定位和半定量PCR进行表达分析研究,主要研究内容和结果如下:1.根据玉米B73和水稻的寡肽转运蛋白全长序列设计引物,通过RT-PCR直接扩增的方法从玉米自交系掖478中克隆到了寡肽转运蛋白基因,命名为ZmOPT0212（基因登录号: HM021150）。ZmOPT0212开放阅读框为2151bp,编码716个氨基酸残基、等电点8.87、相对分子质量为77.4 kDa。2.生物信息学分析,寡肽转运蛋白其二级结构约含43.85%的α-螺旋、3.91%的β-转角、13.27%的延伸链和38.97%的不规则卷曲,含有14个连续的疏水片断,其中12个可能构成跨膜螺旋;预测该转运蛋白不存在信号肽,可能存在于细胞膜上。保守结构域预测编码蛋白属于OPT蛋白家族。通过蛋白功能预测,该蛋白具有转录、转录调控、信号转导、金属离子转运、转运及与底物结合等功能。同源性和进化树的预测分析显示,ZmOPT0212蛋白与水稻、拟南芥、毛果杨和蓖麻等高等植物的寡肽转运蛋白同源性分别达到了99%、96%、92%和92%。3.亚细胞定位,构建融合表达载体35s-GFP-ZmOPT0212,用基因枪转入洋葱表皮细胞观察其在细胞中的定位,结果显示转化质粒在洋葱表皮细胞的细胞膜部位有明显的荧光,初步证明ZmOPT0212位于细胞膜中。4.半定量分析结果表明,在非胁迫条件下,ZmOPT0212基因在幼嫩叶和根部都有表达。同样方法分析在非生物胁迫条件下掖478及其三个导入系中目的基因,发现该基因在叶和根中均有表达。以掖478表达为参照,胁迫条件下IL26中ZmOPT0212基因的表达量一直持上升趋势,而其他两个导入系的表达情形都是在氮胁迫初期有迅速的增加,随后趋于稳定或者有所下降。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 研究背景
• 1.2 高等植物肽转运蛋白的研究进展
• 1.2.1 寡肽转运蛋白概述
• 1.2.2 水稻寡肽转运蛋白的研究进展
• 1.2.3 拟南芥寡肽转运蛋白的研究进展
• 1.3 亚细胞定位的研究进展
• 1.4 半定量分析的研究进展
• 1.5 本研究的内容及意义
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株及质粒载体
• 2.1.3 酶和试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 玉米幼嫩叶片cDNA 的获得方法
• 2.2.2 ZmOPT0212 基因的克隆
• 2.2.3 ZmOPT0212 基因编码蛋白的生物信息学分析
• 2.2.4 亚细胞定位载体的构建及表达
• 2.2.5 半定量RT-PCR 分析
• 2.2.6 ZmOPT0212 基因原核表达载体和真核表达载体的构建
• 3 结果与分析
• 3.1 玉米ZmOPT0212 基因的克隆
• 3.1.1 总RNA 含量和质量的检测
• 3.1.2 ZmOPT0212 基因的获得
• 3.2 ZmOPT0212 编码蛋白的生物信息学分析
• 3.2.1 ZmOPT0212 基因编码蛋白序列特征分析
• 3.2.2 ZmOPT0212 编码蛋白信号肽预测和分析
• 3.2.3 ZmOPT0212 编码蛋白疏水性/亲水性的预测和分析
• 3.2.4 ZmOPT0212 编码蛋白二级结构预测和分析
• 3.2.5 ZmOPT0212 编码蛋白跨膜结构域分析
• 3.2.6 ZmOPT0212 编码蛋白的保守结构域预测
• 3.2.7 ZmOPT0212 编码蛋白的亚细胞定位的预测
• 3.2.8 ZmOPT0212 编码蛋白的功能预测
• 3.2.9 ZmOPT0212 编码蛋白的模体分析
• 3.2.10 钙调素结构域的分析
• 3.2.11 同源比对与系统进化树构建
• 3.3 ZmOPT0212 的洋葱表皮细胞定位
• 3.3.1 目的片段的扩增及测序
• 3.3.2 目的基因和表达载体的链接
• 3.3.3 洋葱表皮细胞定位结果
• 3.4 ZmOPT0212 基因响应非生物胁迫的转录表达水平
• 3.4.1 最佳循环数的确定
• 3.4.2 胁迫条件下478 及其导入系幼嫩叶片中ZmOPT0212 的mRNA 水平分析
• 3.4.3 胁迫条件下478 及其导入系根部 ZmOPT0212 的mRNA 水平分析
• 3.5 原核表达载体和真核表达载体的构建
• 3.5.1 原核表达载体的构建
• 3.5.2 真核表达载体的构建
• 4 讨论
• 4.1 不同物种寡肽转运蛋白具有类似的跨膜结构和保守序列
• 4.2 ZmOPT0212 基因功能预测
• 4.3 ZmOPT0212 基因的洋葱表皮细胞定位
• 4.3.1 关于引物的选择和设计
• 4.3.2 ZmOPT0212 的洋葱表皮细胞定位
• 4.4 ZmOPT0212 基因在478 及其导入系中的表达分析
• 4.5 ZmOPT0212 编码蛋白在大肠杆菌中的无效表达分析
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 在读期间发表的学术论文
• 作者简历
• 致谢