头孢菌素C高产菌株选育及发酵特性研究

论文摘要

本论文以头孢菌素C产生菌顶头孢霉菌为研究对象,通过传统理化诱变选育、复合诱变选育、推理选育及递归原生质体融合（Genome shuffling）技术选育,筛选头孢菌素C高产菌株,并进行相关发酵特性的研究和发酵条件优化实验,为顶头孢霉工业生产提供了菌株优化改良的实验思路。首先,以顶头孢霉ys-3为出发菌株通过紫外线、亚硝酸及其复合诱变技术进行菌种的初步优化选育,摸索合适的诱变剂量,确定最佳紫外诱变条件为30 W紫外灯下15 cm处照射120 s,亚硝酸诱变条件为亚硝酸浓度50 mmol/L,诱变处理120 s时为最佳,多轮次诱变积累,共挑选出879株诱变子,通过琼脂柱托盘抑菌高通量筛选,获得了高产菌株FH-127,较出发菌株抑菌圈直径提高了80%。然后,以诱变菌株FH-127为出发菌株,根据头孢菌素C的生物合成途径,选择丙二酸、重金属铜离子和头孢菌素C钠盐作为筛选耐受压力,确定丙二酸、铜离子、头孢菌素C钠盐浓度分别为1%、0.06%、8 g/L时为临界耐受浓度,分别收集得到铜离子耐受菌株269株,丙二酸耐受菌株187株,终产物耐受菌株273株,经过琼脂柱托盘抑菌实验初筛,摇瓶发酵HPLC复筛,获得高产耐受菌株T-01069、TB-69068、TBC-68187、TBC-68071,为下一步Genome shuffling融合奠定基础。采用Genome Shuffling技术,对原生质体制备菌龄,酶解时间及高渗液的选择进行优化,确定了最佳原生质体制备条件和再生方式,在30% PEG 6000介导下对紫外和加热双亲灭活的原生质体进行融合10 min,PDA培养基双层平板再生,并将所得的性状优良突变株进行递归融合选育,琼脂柱抑菌筛选并通过HPLC检测,将选育出的多优良性状进行整合,获得高产融合子G4-13,且比原始菌株产量提高101.4%。在对最终筛选出的高产菌株遗传稳定性实验后,还研究了该菌株的发酵特性,首先分析了发酵过程中菌株对豆油的利用能力,降低了豆油添加量。随后对豆油进行了硅胶柱层析,初步分为极性、中极性和弱极性组分,通过比较发现中弱极性的组分更有利于头孢菌素的合成。接下来还进行了发酵环境的优化实验,分别对其进行接种菌龄、发酵周期及发酵温度优化实验,最终确定最佳优化条件为:接种膨大菌丝阶段时期菌种,控制发酵温度前期28℃,后期25℃,发酵136 h后,此条件HPLC检测头孢菌素C的含量最大。通过发酵特性优化实验,最终减短顶头孢霉发酵周期,降低生产头孢菌素C发酵过程中的豆油添加量和动力高耗问题,为大规模的工业生产降低成本提供很好的实验依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1.1 头孢菌素C 及其产生菌
• 1.1.1 头孢菌素概述
• 1.1.2 头孢菌素分类
• 1.1.3 头孢菌素C 产生菌
• 1.2 头孢菌素C 生物合成途径
• 1.3 头孢类抗生素生产现状
• 1.4 头孢菌素C 发酵工艺及生产现状
• 1.4.1 前体L-α-氨基己二酸
• 1.4.2 碳源
• 1.4.3 氮源
• 1.4.4 蛋氨酸
• 1.4.5 溶氧水平
• 1.4.6 选择性呼吸途径
• 1.4.7 金属离子
• 1.5 顶头孢霉的优化选育
• 1.5.1 传统诱变育种技术
• 1.5.2 原生质体融合技术
• 1.5.3 基因工程技术
• 1.5.4 推理选育技术
• 1.6 课题的研究内容及意义
• 1.7 课题研究技术路线
• 第2章 顶头孢霉菌理化诱变条件优化
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 菌种
• 2.2.2 培养基及缓冲液
• 2.2.3 仪器及试剂
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 诱变出发菌株的选择
• 2.3.2 紫外诱变处理
• 2.3.3 化学诱变条件优化
• 2.3.4 紫外线和亚硝酸复合诱变
• 2.3.5 多轮次累积诱变
• 2.3.6 诱变子的生物活性高通量筛选——托盘琼脂柱筛选法
• 2.4 实验结果
• 2.4.1 出发菌株选择
• 2.4.2 紫外诱变致死曲线的绘制
• 2.4.3 亚硝酸诱变结果
• 2.4.4 紫外和亚硝酸复合诱变结果
• 2.4.5 多轮次的诱变积累
• 2.4.6 诱变子的高通量的筛选
• 2.5 本章小结
• 第3章 头孢菌素 C 高产菌株的推理选育
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 菌种
• 3.2.2 培养基及缓冲液
• 3.2.3 仪器及试剂
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 铜离子耐受高产菌株的选育
• 3.3.2 丙二酸耐受菌株筛选
• 3.3.3 产物耐受型高产菌株的选育
• 3.3.4 突变子的生物活性高通量筛选——托盘琼脂柱筛选法
• 3.3.5 HPLC 法验证头孢菌素C 产量
• 3.3.6 高产菌株遗传稳定性实验
• 3.4 实验结果
• 3.4.1 铜离子耐受菌株选育
• 3.4.2 丙二酸耐受突变株的筛选
• 3.4.3 终产物耐受突变株的筛选
• 3.4.4 摇瓶复筛
• 3.5 本章小结
• 第4章 顶头孢霉的 Genome shuffling
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料
• 4.2.1 菌种
• 4.2.2 培养基及缓冲液
• 4.2.3 仪器及试剂
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 出发菌株的选择
• 4.3.2 原生质体的制备条件优化
• 4.3.3 原生质体的再生条件优化
• 4.3.4 原生质体双亲灭活条件优化
• 4.3.5 原生质体的融合
• 4.3.6 多轮次Genome shuffling
• 4.3.7 融合子的筛选和产量验证
• 4.4 实验结果
• 4.4.1 原生质体制备菌龄选择结果
• 4.4.2 原生质体高渗液选择结果
• 4.4.3 原生质体酶解时间的确定
• 4.4.4 原生质体再生培养基的选择
• 4.4.5 原生质体灭活条件优化
• 4.4.6 原生质体融合结果
• 4.4.7 融合子积累筛选和产量验证
• 4.5 本章小结
• 第5章 高产菌株 G4-13 发酵特性研究
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 菌株和保存
• 5.2.2 培养基及缓冲液
• 5.2.3 仪器及试剂
• 5.3 豆油的利用能力试验
• 5.3.1 豆油添加量对头孢菌素C 产量的影响
• 5.3.2 豆油添加时间对头孢菌素C 产量的影响
• 5.3.3 豆油作用机理
• 5.4 发酵周期及发酵环境要求实验
• 5.4.1 接种菌龄与产量的关系
• 5.4.2 发酵周期实验
• 5.4.3 发酵温度实验
• 5.4.4 500L 发酵罐中试生产实验
• 5.5 实验结果
• 5.5.1 豆油添加量实验结果
• 5.5.2 豆油添加时间与头孢菌素C 产量关系
• 5.5.3 豆油平板点种实验
• 5.5.4 豆油萃取实验
• 5.5.5 豆油柱层析实验
• 5.5.6 豆油组分添加实验
• 5.5.7 菌龄接种实验结果
• 5.5.8 发酵周期实验结果
• 5.5.9 发酵温度实验结果
• 5.5.10 发酵中试生产结果
• 5.6 本章小结
• 第6章 全文总结与展望
• 6.1 全文总结
• 6.2 问题与展望
• 参考文献
• 致谢
• 在学期间主要科研成果