甘蓝型油菜隐性核不育恢复基因BnMS2的精细定位与候选基因鉴定

论文摘要

油菜是我国主要的油料作物,而杂种优势利用又是提高油菜产量、缓解产量与品质之间矛盾、增强品种抗（耐）逆性的一条有效途径。油菜隐性细胞核雄性不育具有不育性彻底稳定、细胞质来源丰富、恢复源广等优点,在国内已经成为杂种优势利用的一个重要途径,但在杂交制种时需人工拔除母本行中50%的可育株,限制了其广泛应用。隐性细胞核雄性不育材料S45A的不育性受两对重叠隐性基因控制（潘涛等,1988）,S45B的BnMs1位点处于杂合状态,而Bnms2位点处于隐性纯合状态。本研究以S45A和育性正常的普通甘蓝型油菜IL362-2-4为材料通过两亲本的杂交、自交、兄妹交及等位性分析构建了在BnMs2位点分离的近等基因系S4516AB,在此基础上对隐性核不育基因BnMs2进行了精细定位,克隆和转基因研究,一方面为雄性不育的选育提供分子标记,另一方面以期加深对雄性不育机理的认识。主要研究结果如下：1.对S4516B和S45B的杂合位点进行等位性分析,为S4516AB定位群体的确立打下了基础。通过对NIL系S4516AB的育性调查结果表明,兄妹交后代的育性分离比为1：1,可育株自交后代的育性比例符合3：1,说明S4516B为单位点杂合,结合等位性分析的结果证实了两型系S4516AB的基因型,不育株S4516A为Bnms1Bnms1 Bnms2bnms2,可育株S4516B为Bnms1Bnms1 BnMs2Bnms2。2.利用AFLP结合BSA的分析方法,通过筛选1024对AFLP引物组合找到了与BnMs2连锁的AFLP标记12个,在262株的NIL分离群体中对BnMs2进行了初步定位,将目标基因锁定在3.5cM内,另外8个AFLP标记与BnMs2共分离。3.对12个AFLP标记回收克隆测序后,用PCR walking分离了8个共分离标记的侧翼序列,延长后的标记序列长度在815-2661bp之间,并成功转化了5个SCAR标记,其中2个为共显性标记。继续在2650株的不育大群体中采用改良的混合样品作图法和侧翼分子标记分析法对BnMs2进行精细定位,将8个在小群体中共分离的标记定位在BnMs2两侧1.0cM区域内,其中最近标记Lm10和Lm11距目标基因分别只有0.038cM和0.075cM。4.通过图谱定位将与BnMs2连锁的4个标记整合到2个DH群体（Tapidor×Ningyou7和Quantum×No.2127-17）的连锁群上,成功将BnMs2定位到甘蓝型油菜C基因组N16染色体上。并在TN群体的N16连锁群上找到1个共显性的SSR标记Na12A05。5.延伸后的标记序列与拟南芥进行同源性比较,在拟南芥第1条染色体下方找到一个包含121个拟南芥基因的共线性区域。基于拟南芥基因组信息及网上大量芸苔属EST、GSS、BAC序列信息,开发了1个ACGM标记B14,同时Lm10经1个白菜BAC为桥梁被定位在拟南芥基因Atlg69510和Atlg69520之间。B14和Lm10将BnMs2在拟南芥上的候选基因缩小到12个。由于BnMs2和BnMs1功能相同,都可以恢复S45A和S4516A不育株的育性,而本定位研究筛选出的12个候选基因又包括BnMs1的2个候选基因,因此BnMs2基因也必在BnMs1的2个候选基因中,将这2个BnMs2的候选基因命名为BnG1和BnG2。6.对2个候选基因BnG1、BnG2分别构建转基因表达载体p2301G1和p2301G2进行互补测验,以S4516AB为外植体通过农杆菌介导的遗传转化均获得了转基因阳性株。在7株BnG1的转化株中,S4516A没有能恢复育性；在3株BnG2的转化株中,也没有发现S4516A育性恢复。7.根据BnMs1和BnG2基因cDNA5’端的保守序列构建反义表达载体p2301AntiG2,通过转基因对Westar中的BnMs1和BnG2进行反义抑制,获得了20株阳性株,对其中12株在花期进行育性检测没有发现预期的不育表型。8.构建候选基因BnG2启动子的GUS融合基因表达载体p121P2GUS,对目标基因启动子进行组织特异性表达分析。经对11株阳性株的GUS染色,成功地分离了BnG2启动子,结果显示该基因仅限在花药某一特定时期（花蕾1-3mm）表达,在其它组织器官中均无表达。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 1 文献综述
• 1.1 油菜雄性不育与杂种优势利用的关系
• 1.1.1 细胞质雄性不育
• 1.1.2 细胞核雄性不育
• 1.2 油菜细胞核雄性不育的研究进展
• 1.2.1 油菜细胞核雄性不育的育性分类
• 1.2.2 油菜细胞核雄性不育的遗传分类
• 1.2.2.1 两对显性基因互作控制的细胞核雄性不育
• 1.2.2.2 一对复等位基因控制的细胞核雄性不育
• 1.2.2.3 两对隐性基因控制的细胞核雄性不育
• 1.2.2.4 隐性上位基因互作控制的细胞核雄性不育
• 1.2.2.5 转基因的细胞核雄性不育
• 1.2.3 油菜细胞核雄性不育基因的定位
• 1.2.4 油菜细胞核雄性不育的分子机理
• 1.3 甘蓝型油菜的遗传连锁图谱及重要基因的定位
• 1.3.1 甘蓝型油菜的遗传连锁图谱
• 1.3.2 甘蓝型油菜重要基因的定位
• 1.3.2.1 品质性状相关基因的定位
• 1.3.2.2 抗病性状相关基因的定位
• 1.3.2.3 种皮颜色相关基因的定位
• 1.3.2.4 育性相关基因的定位与分离
• 1.4 图位克隆技术的原理及基本技术环节
• 1.4.1 目的基因的分子标记定位
• 1.4.2 基因组文库的构建
• 1.4.3 构建目的基因区域的物理图谱
• 1.4.4 候选基因的确定与功能验证
• 1.5 芸薹属作物与拟南芥比较基因组研究
• 1.5.1 比较基因组学
• 1.5.2 芸薹属作物的比较基因组研究
• 1.5.3 芸薹属植物与拟南芥之间的共线性研究
• 1.5.3.1 宏观共线性
• 1.5.3.2 微观共线性
• 1.5.3.3 ACGM标记——扩增共有序列遗传标记
• 1.5.4 芸薹属作物与拟南芥比较基因组研究对于基因克隆的意义
• 1.6 本研究的目的和意义
• 2 材料和方法
• 2.1 试验材料
• 2.2 群体构建及等位性分析
• 2.2.1 群体构建
• 2.2.2 等位性分析
• 2.3 AFLP与BSA分析
• 2.3.1 DNA提取及样品池的构建
• 2.3.2 AFLP分析
• 2.3.2.1 总DNA的酶切和连接
• 2.3.2.2 预扩增
• 2.3.2.3 选择性扩增
• 2.3.2.4 电泳检测
• 2.4 SCAR标记转化
• 2.4.1 大肠杆菌（Ecoli）感受态细胞的制备
• 2.4.2 差异片段的回收与连接
• 2.4.3 差异片段的克隆与测序
• 2.4.3.1 连接子的转化
• 2.4.3.2 重组子的筛选与鉴定
• 2.4.4 PCR walking
• 2.4.5 SCAR引物设计及检测
• 2.5 SSR分析
• 2.6 BnMs2基因的粗定位和精细定位及遗传图谱的绘制
• 2.7 BnMs2基因的图谱定位
• 2.8 标记序列与拟南芥的同源性比对及ACGM标记开发
• 2.8.1 标记序列的BLAST分析
• 2.8.2 ACGM标记的开发
• 2.9 农杆菌介导的遗传转化
• 2.9.1 植物表达载体的构建
• 2.9.1.1 p2301G1与p2301G2表达载体的构建
• 2.9.1.2 p2301AntiG2反义载体的构建
• 2.9.1.3 p121P2GUS启动子分析表达载体的构建
• 2.9.2 油菜的遗传转化
• 2.9.3 转基因植株的检测
• 2.9.3.1 转基因植株的PCR检测
• 2.9.3.2 转基因植株的GUS活性检测
• 2.9.3.3 转基因植株育性的分子标记检测
• 3 结果与分析
• 3.1 S4516AB群体的构建
• 3.2 S4516AB不育性状的遗传分析
• 3.3 S45AB与S4516AB杂合位点的等位性分析
• 3.4 与BnMs2连锁的AFLP标记
• 3.5 BnMs2基因的初步定位
• 3.6 SCAR标记转化
• 3.6.1 差异片段的克隆测序
• 3.6.2 AFLP侧翼序列的分离
• 3.6.3 SCAR标记的获取
• 3.7 BnMs2基因的图谱定位
• 3.7.1 在TN群体和QN群体上的图谱定位
• 3.7.2 借助图谱标记信息发展新的SSR标记
• 3.8 BnMs2基因的精细定位
• 3.9 基于标记序列BLAST分析的候选基因鉴定
• 3.9.1 与拟南芥基因组的同源性比较
• 3.9.2 ACGM标记的开发
• 3.9.3 基于白菜BAC序列的候选基因筛选
• 3.10 BnMs2基因的BAC克隆筛选、候选基因的预测及测序
• 3.11 油菜的遗传转化
• 3.11.1 BnMs2基因的互补测验
• 3.11.1.1 表达载体的构建
• 3.11.1.2 转基因阳性株的获取与育性检测
• 3.11.2 候选基因BnG2基因的反义抑制
• 3.11.2.1 反义载体的构建
• 3.11.2.2 反义抑制阳性株的获取与表型检测
• 3.11.3 候选基因BnG2基因启动子的分离与组织特异性表达分析
• 3.11.3.1 启动子分析表达载体的构建
• 3.11.3.2 BnG2基因启动子的分离与花药特异表达
• 3.12 小结
• 4 讨论
• 4.1 候选基因BnG2可能就是BnMs2
• 4.2 侧翼分子标记分析结合混合样品作图可以提高基因精细定位的效率
• 4.3 利用拟南芥基因组信息定位基因与筛选候选基因的一些思考
• 4.4 甘蓝型油菜转基因沉默的启示
• 4.5 双隐性核不育制种时拔除50%可育株问题的基因工程解决思路
• 5 参考文献
• 附录
• 附录1:油菜转基因所用的培养基
• 附录2:GUS染色液的配制
• 附录3:作者简介和在读期间发表论文
• 作者简介
• 在读期间发表论文
• 致谢