黄脸油葫芦和云斑金蟋线粒体基因组全序列的测定与分析

论文摘要

动物线粒体基因组具有多态性显著、进化速率快、母系遗传和几乎不发生重组等特点,是研究基因结构、功能、转录及表达的良好模型。目前,NCBI中已收录的后生动物全线粒体基因组序列共1212种。其中,脊椎动物870种,六足类动物（Hexapoda）81种,直翅目中公布的数据有非洲飞蝗（Locusta migratoria）、东方蝼蛄（Gryllotalpa orientalis）、中华稻蝗（Oxyachinensis）、摩门螽斯（Anabrus simplex）和疑钩额螽（Ruspolia dubia）。为了进一步研究直翅目昆虫线粒体基因组的结构与进化特征,同时也为丰富直翅目昆虫线粒体基因组全序列的数据,以便为研究直翅目乃至多新翅类的系统发育关系提供更多的生物分子数据。本研究选取直翅目蟋蟀总科的黄脸油葫芦（Teleogryllus emma）和云斑金蟋（Xenorryllus marmoratus）作为研究对象,采用基于长-PCR（Long Polymerase ChainReaction,L-PCR）扩增及保守引物步移（Conserved Primer Walking）策略,PCR直接测序与克隆测序相结合的方法,完成了对上述两种蟋蟀的线粒体基因组全序列的测定。参照非洲飞蝗（Locusta migratoria）和东方蝼蛄（Gryllotalpa orientalis）线粒体基因组注释信息,对拼接之后的两条线粒体基因组全序列完成了注释,并结合相关物种全序列的信息,进行了综合分析。联合直翅目已公布的,以及本实验室尚未公布的线粒体基因组全序列数据,对由N链编码的ND还原酶亚单位基因（ND5、ND4、ND4L、ND1）在构建系统发育树时的适用性进行了检验,同时也对直翅目中各类群的系统发育关系进行了初步讨论。主要结果如下:1、黄脸油葫芦和云斑金蟋的线粒体基因组全序列长度分别为15660bp和15583bp,均包括13个蛋白质编码基因,22个tRNA基因,2个rRNA基因和位于SrRNA与tRNA(（Ile）之间的A+T富集区,两种蟋蟀线粒体基因组的碱基组成具有明显的偏向性,A+T含量分别为73.1%和71.8%;2、云斑金蟋的线粒体基因组存在两段较长的基因间隔序列,其一位于tRNAGln和tRNAMct之间（IR-1）,长度94bp;其二位于tRNASer（UCN）和ND1之间（IR-2）,长度99bp。两段间隔区的A+T含量分别为77.7%和71.7%。在这两个基因间隔区内,各发现了一个类tRNA（tRNA-Like）基因:IR-1中为类tRNAVal;IR-2中的为类tRNALeu（CUN）,它们都能形成tRNA所共有的三叶草结构,并且具有和正常tRNA相同的反密码子,由于这是一个十分罕见的现象,我们对其所具有的功能不能确定,但倾向于将其认定为假基因;3、两种蟋蟀线粒体基因组中,出现了一种在直翅目乃至昆虫纲中——新的基因排列方式,即tRNAGlu、tRNASer（AGN）和tRNAAsn由N链编码。不是通常的ARNSEF结构,而形成了ARESNF结构;同时,tRNALys与tRNAAsp之间的结构,也与非洲飞蝗DK结构相反,而与直翅目螽亚目的KD结构一致;4、黄脸油葫芦和云斑金蟋的线粒体基因组中的COⅠ基因,不是由标准的ATN,而是由TTA作为起始密码子。而黄脸油葫芦线粒体基因组中,有10种蛋白质编码基因的终止密码子为完整的TAA或TAG,而COⅡ、ND5和DN4则以不完整的T作为终止密码子。云斑金蟋中则是除COⅡ和ND5以不完整的T作为终止密码子之外,其余的11种蛋白质都以TAA或TAG作为终止密码子:5、22种tRNA除tRNA-Ser（AGN）缺失D-臂外,都可以形成典型的三叶草结构,携带的反密码子与多数的六足类动物一致。多为GNN或UNN。tRNA的4个臂上存在不同程度的碱基错配,错配类型多为G-U配对;6、通过统计密码子使用的频率及与反密码子配对的情况,加之对直翅目两个亚目的7个物种线粒体基因组内tRNA基因A+T含量的统计,我们试着对密码子的进化进行了初步讨论;7、通过对A+T富集区的研究,发现除早期分化的类群（如弹尾目）外,普遍存在于六足总纲A+T富集区的二级结构是一个以TA起始,茎上具有6个碱基对的茎.环结构。同时,经过Z-曲线的计算,推测了黄脸油葫芦和云斑金蟋线粒体基因组N链的复制起点ON,其分别位于两个线粒体基因组的区间（15100-15119）和区间（15030-15049）;8、联合直翅目28个线粒体基因组中由N链编码的ND还原酶亚单位基因（ND5、ND4、ND4L,NDl）,以最大似然法（Maximum Likelihood,ML）为例,对其在构建系统发育树时的适用性进行了检验,同时也对直翅目中各类群的系统发育关系进行了初步讨论。系统树中显示,蟋蟀总科作为直翅目的基部类群,是具有单系性的,这与根据tRNA基因的排列结构得出的结论是相一致的。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 前言
• 1 基因组学研究概述
• 1.1 基因组及基因组学简介
• 1.2 基因组学发展及研究现状
• 2 线粒体及线粒体基因组
• 2.1 线粒体介绍
• 2.2 线粒体基因组特征
• 2.3 线粒体DNA的复制
• 2.4 线粒体DNA的转录
• 3 线粒体基因组研究进展
• 3.1 蛋白编码基因与起始密码子
• 3.2 tRNA基因与基因倒置
• 3.3 控制区的重复序列、调控序列与保守的二级结构
• 4 动物线粒体基因组测序进展及应用价值
• 5 线粒体基因组的研究方法
• 5.1 线粒体基因组的纯化
• 5.2 测序方法
• 5.3 基因组序列数据的拼接及注释
• 6 直翅目昆虫的分类简介
• 6.1 直翅目简介
• 6.2 蟋蟀总科简介
• 6.3 黄脸油葫芦和云斑金蟋简介
• 7 本研究的目的和意义
• 第二部分 材料与方法
• 1 实验材料
• 1.1 实验标本采集、保存和鉴定
• 1.2 实验仪器和试剂
• 2 实验方法
• 2.1 总DNA提取
• 2.2 PCR引物设计及PCR扩增
• 2.3 Sub-PCR扩增产物测序
• 3 数据处理和分析
• 3.1 测序数据的收集和前期处理
• 3.2 序列的拼接和组装
• 3.3 线粒体基因组序列的注释与基因定位
• 4 利用Z-曲线识别黄脸油葫芦及云斑金蟋N链复制起点
• 5 直翅目昆虫的系统发育分析
• 5.1 数据集的g1统计值检验和PTP检验:
• 5.2 最大似然法建树
• 第三部分 实验结果分析
• 1 基因组总DNA提纯
• 2 PCR扩增、纯化及测序
• 2.1 PCR扩增和纯化
• 2.2 Sub-PCR扩增和纯化
• 2.3 Sub-PCR产物测序
• 3 序列拼接和注释
• 4 线粒体基因组基因组成、结构及基本特征
• 4.1 黄脸油葫芦线粒体基因组
• 4.2 云斑金蟋线粒体基因组
• 第四部分 黄脸油葫芦与云斑金蟋线粒体基因组比较分析及讨论
• 1 黄脸油葫芦和云斑金蟋线粒体基因组碱基组成
• 2 线粒体基因排列次序
• 3 密码子变异
• 4 A+T富集区的重复序列、调控序列与保守的二级结构
• 5 基因间隔序列及多余tRNA结构
• 6 密码子的使用及与tRNA之间的关系
• 7 Z-曲线对黄脸油葫芦及云斑金蟋N链复制起点的识别结果
• 8 N链编码的ND还原酶亚单位基因在系统发育分析中的适用性及对直翅目内系统发育关系的讨论
• 总结
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间的研究成果