论文摘要
研究背景：大段骨缺损的重建修复是骨外科常见的重要的临床难题。当前临床治疗方法主要包括骨材料移植（自体移植、同种异体移植或异种移植）、不同生物材料植入或骨传输生长方法（Ilizarov技术）,但这些技术均存在一定的不足,不能满足临床需要。近年来骨组织工程的迅速发展为骨缺损的治疗提供了新的思路,并且已由基础研究过渡到临床的初步应用阶段。临床应用不同于动物实验,首先需要考虑治疗的安全性。因此骨组织工程种子细胞的选择,材料的选择以及种子细胞的体外培养过程等问题都是需要谨慎注意的。骨髓基质干细胞（marrow mesenchymal stromal cells, MSCs）因其取材方便,可在体外大量扩增并保持成骨潜能,较低的免疫原性,转入外源基因后不影响其增殖、分化特性等特点,被认为是骨组织工程理想的种子细胞。传统的细胞培养方法采用胎牛血清作为营养支持。尽管优质胎牛血清经过了严格的处理,但仍然存在潜在传播疾病的风险和免疫排斥反应。许多研究者采用无血清培养方法,但代价太高,并且周期较长,约40 d～45 d；应用诱导剂和细胞因子,费用也相当可观。寻找胎牛血清替代物并建立成人骨髓基质干细胞（human bone marrow mesenchymal stromal cells, hBMSCs）规范、安全、高效的体外培养体系刚刚起步,有待进一步研究。本研究采用AB血清（AB serum,ABS）、自体血清（autologous serum, AS）替代胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）作为营养基质,比较3种不同培养体系体外培养hBMSCs增殖分化的效果,为骨组织工程由基础研究向临床应用提供一定的理论依据。研究目的探讨AB血清、自体血清替代胎牛血清体外培养成人骨髓基质干细胞增殖及成骨分化的效果,并初步探讨其促成骨的机制。实验方法1.自体及AB血清的制备选取6名捐献骨髓健康志愿者和6名AB血型健康志愿者（均已签署知情同意书）,分别在空腹无菌条件下抽取约50ml外周静脉血,不添加抗凝剂,4℃过夜。其中,将采集的6份AB血型非抗凝血混合均匀制备AB血清,而捐献骨髓者的非抗凝血不混合,分别制备自体血清。经过二次重复离心,吸取上层血清于离心管中,水浴灭活,过滤除菌,加入DMEM基础培养基中或-20℃保存。2.骨髓基质干细胞的分离培养常规无菌条件下抽取6名捐献骨髓健康志愿者骨髓（均已签署知情同意书）。按照不同血清分为三组：胎牛血清（10%胎牛血清）组、AB血清（10%AB血清）组和自体血清（10%自体血清）组。采用全骨髓法进行hBMSCs原代培养。细胞达到70%融合后,按1：3比例传代培养。将第3代各组hBMSCs植入6孔板中培养,次日予成骨、成脂诱导液培养,观察细胞生长情况。3.骨髓基质干细胞的鉴定取第3代各血清组hBMSCs,使用流式细胞仪鉴定细胞表面标志物CD14、CD29、CD34、CD44、CD45和CD105的表达情况。各血清组hBMSCs成骨、成脂诱导培养10d、21d。在10d进行ALP染色,ALP阳性细胞染为蓝紫色；在21d进行茜素红及油红O染色,钙结节染为棕红色,油红O阳性染为红色脂滴。4.骨髓基质干细胞的增殖检测取第3代各组hBMSCs（密度1×103细胞/孔）接种于96孔板,每孔加入100μl完全培养基,每个测试时间点每组各5孔。于培养后1、3、5、7、9、11d,各孔加入10μl AlamarBlue工作液,孵育4h,酶标仪上测定荧光强度。取第3代各组hBMSCs,采用Annexin V-FITC试剂,使用流式细胞仪检测各组hBMSCs凋亡率。5.骨髓基质干细胞的分化检测诱导培养后4d、7d、14d和21d,各血清组诱导的细胞分别进行钙黄绿素法荧光显微镜动态观察矿盐沉积,检测碱性磷酸酶活性,实时荧光定量PCR法检测成骨基因碱性磷酸酶、骨桥蛋白和骨钙素的表达。6.统计方法整体比较采用重复测量数据的方差分析；同一组别不同时间点的比较采用重复测量数据的方差分析；同一时间点不同组别的比较采用One-Way ANOVA进行分析,用LSD法对各组数据进行多重比较,若经Levene检验,数据不满足方差齐性,则采用方差分析的近似方法Dunnet’s T3法进行统计分析。检验水准a=0.05。实验结果1.自体及AB血清的制备经二次离心灭活后,自体血清、AB血清均透亮,淡黄色,无絮状物。2.骨髓基质干细胞的培养、扩增各血清组原代细胞培养4d换液后仍见大量圆盘状红细胞滞悬于底层培养基中；但在培养瓶底部可见数个成簇生长的贴壁细胞克隆集落,细胞成纺锤形、梭形；培养7-9d后,贴壁细胞克隆集落数量明显增加；12-14d后细胞可达到80-90%融合。传代后,24h完全贴壁、伸展,重新成为长梭形,细胞增殖旺盛。hBMSCs传至第3代,细胞较为均一,杂细胞逐渐消失。3.骨髓基质干细胞的鉴定成骨诱导培养后,各组细胞形态相似,细胞逐渐出现层叠、聚集生长态势,融合的细胞层呈现“网格状”改变,细胞体积变大、形态呈多边形,核大,核仁清晰,细胞内颗粒增多,细胞外基质分泌旺盛,培养液中可见大量棕黑色颗粒物质。成脂诱导培养后,各血清组细胞中逐渐有小脂滴出现,主要集中在细胞核周围,随时间延长,小脂滴逐渐聚集成大的脂泡,细胞有原来的梭形变为圆形或多角形。细胞表面标志物结果显示：各血清组细胞CD29、CD44和CD105均呈强阳性表达（98%以上）；各组细胞CD14、CD34和CD45均呈阴性表达（2%以下）,各组之间无统计学意义（P>0.05）。细胞化学染色结果显示：各血清组细胞碱性磷酸酶、油红O、茜素红染色均为阳性表达。4.骨髓基质干细胞增殖的检测结果随培养时间的延长,各血清组荧光强度值逐渐增加,第7天时最高。培养后3d、5d、7d、9d和11d,AB血清组的荧光强度值均高于胎牛血清组和自体血清组（P<0.05）。AB血清促hBMSCs曾殖的效率最高。流式细胞仪检测细胞凋亡率结果显示,胎牛血清组细胞凋亡率为（4.34±0.59）%,自体血清组为（4.31±0.70）%,AB血清组为（4.33±0.76）%。各组之间无统计学意义（P>0.05）。各血清组细胞生长良好。5.骨髓基质干细胞分化的检测结果hBMSCs成骨诱导4d、7d、14d和21d时,测得各组每孔DNA含量。各相同时间点,各组间均无显著性差异（P>0.05）。将所测DNA含量与碱性磷酸酶活性标准化为每100μgDNA中碱性磷酸酶的活性。各相同时间点,AB血清组细胞碱性磷酸酶活性均高于胎牛血清组、自体血清组,且于7d出现峰值；自体血清组碱性磷酸酶活性最低,各组间差异均有统计学意义（P<0.05）。荧光显微镜下各组细胞外矿盐沉积在4d时尚未形成,7d时矿盐沉积呈散点式分布。14d时矿盐沉积明显增多,少许的呈团簇状分布。21d时,细胞间隙中可见呈团簇状分布的矿盐沉积；其中,AB血清组呈现大量团簇状分布的钙盐沉积,较胎牛血清组、自体血清组明显增多,自体血清组钙盐沉积量最少。实时荧光定量PCR检测成骨基因结果显示：在7d、14d和21d,AB血清组碱性磷酸酶、骨桥蛋白和骨钙素成骨基因表达均明显高于胎牛血清组、自体血清组,其中,碱性磷酸酶基因表达在7d出现峰值,骨桥蛋白基因表达在14d出现峰值,骨钙素基因表达在21d出现峰值,差异均有统计学意义（P<0.05）。结论1.髂骨骨髓穿刺可分离出成人BMSCs.本实验证明,采用AB血清和自体血清培养的hBMSCs生长至第3代时,纯度较高,活力旺盛,并具有向成骨细胞和脂肪细胞分化的潜能。hBMSCs来源丰富,取材容易,创伤小,是理想的组织工程种子细胞,具有广阔的应用前景。2.AB血清对hBMSCs增殖和成骨分化作用较胎牛血清、自体血清明显增强。AB血清取材容易,来源丰富,混合富集后减少了个体间的差异,有望替代胎牛血清建立符合骨组织工程临床应用要求的体外hBMSCs培养体系。