抗鹅细小病毒VP3蛋白单克隆抗体的制备及对应抗原表位的定位

论文摘要

小鹅瘟（Gosling plague,GP）又名鹅细小病毒病,是由鹅细小病毒（Goose Parvovirus,GPV）引起雏鹅、雏番鸭以急性肠炎及肝、肾、心实质器官炎症为特征的烈性传染病。GPV的致病性强,致死率高,对养鹅业的影响严重,造成巨大的经济损失。由于本病长期困扰着养鹅业,因此制备单克隆抗体,并对相应抗原表位进行定位对本病的诊断和防治有重要意义。GPV VP3蛋白是鹅细小病毒的主要结构蛋白,也是病毒的主要衣壳蛋白,暴露于病毒粒子表面,含有GPV主要抗原决定簇,是GPV主要免疫保护性抗原,约占总蛋白的80%。因其能刺激机体产生具有中和作用的抗体,是研制基因工程重组疫苗的首选蛋白。通过免疫VP3蛋白制备抗GPV VP3的单克隆抗体,并利用单克隆抗体对GPV VP3的B细胞抗原表位进行定位,有助于了解其抗原结构与功能的关系,在小鹅瘟病的胶体金、ELISA等临床和实验室检测方法的建立,疫苗研制,疾病治疗等方面起到重要作用。本实验利用Ni-NTA亲和层析纯化后的GPV VP3重组蛋白作为免疫原,经腹腔接种免疫46周龄BALB/c小鼠3次,末次免疫3d后取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,利用已建立的间接ELISA方法进行筛选,经有限稀释法进行4次亚克隆,最终获得4株能稳定分泌抗GPV VP3单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1F1、2A9、3B11、4A2。亚类鉴定1F1为IgG2b亚类,其余3株为IgG1亚类,轻链均为κ链。ELISA检测,其腹水效价分别达到1:819 200、1:1 638 400、1:409 600、1:819 200。Western blot鉴定表明获得的4株单抗均能特异性识别GPV VP3重组蛋白和GPV VP3天然蛋白;免疫电镜和间接免疫荧光证明4株单抗能够与GPV全病毒结合。根据实验室已鉴定的GPV VP3蛋白线性抗原表位区结果,设计并合成互相重叠5个氨基酸的10aa短肽寡聚核酸片段,退火后,连入pET-32a载体,诱导表达获得相应的小片段融合蛋白,利用制备的单抗通过Western blot进行抗原性鉴定。同样方法进行短肽片段两端氨基酸的逐个缺失,进一步定位出两个抗原表位为430435aa和643647aa。本研究制备了抗GPV VP3单克隆抗体,并对相应B细胞抗原表位进行了定位。为建立以表位为基础的抗原抗体诊断方法提供了物质基础,对设计新型GPV亚单位疫苗等方面具有重要意义,单抗和抗原表位均为GPV后续实验奠定物质基础,为其联合应用提供广泛的应用前景。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 鹅细小病毒概述
• 1.1.1 GPV 的分类地位
• 1.1.2 GPV 的形态特征和理化特性
• 1.1.3 GPV 的培养特性
• 1.2 GPV 分子生物学研究进展
• 1.2.1 GPV 基因组的结构特点
• 1.2.2 GPV 基因组的转录和复制
• 1.2.3 GPV 病毒基因编码的结构蛋白
• 1.3 鹅细小病毒病
• 1.3.1 流行病学
• 1.3.2 临床症状及病理变化
• 1.4 鹅细小病毒病的诊断方法
• 1.4.1 病原学检查
• 1.4.2 血清学诊断方法
• 1.5 鹅细小病毒病的防治
• 1.6 细小病毒抗原表位的研究进展
• 1.7 单克隆抗体技术在鹅细小病毒病方面的研究进展
• 1.8 研究目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株、细胞及实验动物
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 主要溶液配制
• 2.1.4 细胞培养溶液
• 2.1.5 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 重组GPV VP3 蛋白的纯化及抗原性鉴定
• 2.2.2 抗GPV VP3 单克隆抗体的制备
• 2.2.3 单克隆抗体的特异性鉴定
• 2.2.4 单克隆抗体的特性鉴定
• 2.2.5 单克隆抗体对相应B 细胞抗原表位的定位
• 3 实验结果
• 3.1 GPV VP3 重组蛋白的诱导表达、纯化及抗原性分析
• 3.1.1 VP3 重组蛋白的诱导表达及纯化
• 3.1.2 VP3 重组蛋白抗原性的Western blot 分析
• 3.2 间接ELISA 筛选方法的建立
• 3.3 杂交瘤细胞株的筛选
• 3.4 单克隆抗体的特异性鉴定
• 3.4.1 单克隆抗体Ig 类型鉴定
• 3.4.2 杂交瘤细胞的染色体鉴定
• 3.4.3 杂交瘤细胞冻存前后稳定性分析
• 3.4.4 腹水效价的检测
• 3.5 单克隆抗体的特性鉴定
• 3.5.1 Western blot 分析
• 3.5.2 Dot-ELISA 鉴定
• 3.5.3 GPV 天然蛋白的鉴定
• 3.5.4 间接免疫荧光检测
• 3.5.5 免疫电镜鉴定
• 3.6 单克隆抗体对相应B 细胞抗原表位的定位
• 3.6.1 单抗针对优势抗原表位区的初步筛选
• 3.6.2 单抗针对优势抗原表位区的进一步鉴定
• 3.6.3 单克隆抗体对抗原表位的定位
• 3.7 抗原表位的分析
• 4 讨论
• 4.1 免疫原的选择
• 4.2 单克隆抗体制备
• 4.3 短肽融合蛋白的获得
• 4.4 单克隆抗体针对的B 细胞抗原表位的定位
• 4.5 抗原表位的分析
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文