TGase1，ACPase及APLPase A2酶活性参与脱屑机理和异常脱屑疗效的探讨

论文摘要

背景正常皮肤表皮细胞中,95%为角质形成细胞（keratinocyte,KC）,其余5%的细胞为黑色素细胞,朗旱氏细胞以及梅克氏细胞。此种角质形成细胞由基底膜上的基底干细胞增殖增大成为棘细胞,进行分化并向浅层移行为颗粒层和角质层。在棘细胞层中,角质形成细胞内分化产物有角质蛋白丝和板层小体等。板层小体内除去脂类以外,还有溶酶体酶（lysosomal enzyme）,如酸性磷酸酶（acid phosphotase,ACPase）、酸性磷脂酶A（acid phospholipase A,APLPase A2）等则分泌至KC之间。它与KC加厚的细胞膜套,即角化膜套（cornified envelope）,及细胞间隙的脂质膜套（lipidenvelope）借助转谷氨酰胺酶1（transglutaminasel,TGase 1）活性的交联作用而共同形成表皮屏障（epidermal barrier）。浅层角质的KC相互解离,凋亡而脱屑。异常脱屑患者的表型呈现KC相互之间不解离而堆积为片状鳞屑。板层鱼鳞病（LI）患者为隐性遗传的KC代谢异常;银屑病为免疫源性炎症的KC代谢异常。两者KC的代谢异常皆可导致凋亡不全(角化不全/凋亡不全（parakeratosis/paraapoptosis）,呈现异常脱屑。临床上常应用尿素、维A酸以及激素等对症治疗异常脱屑,这些药物具有一定疗效,但可呈现副作用,如表皮萎缩和导致表皮屏障功能不良等。Fartasch M等学者曾将低浓度a-羟酸类的乙醇酸应用于表皮脱屑研究。他们认为乙醇酸可降解浅层角质KC间的桥粒物质而脱屑,但并不损害皮肤的屏障功能。关于正常/异常脱屑的机理及对异常脱屑的对症治疗方面国内外研究报道的很有限,但在临床上却是常见的问题。本研究一方面观察不同浓度乙醇酸对不同程度的异常脱屑患者的应用方式;另一方面,通过对比异常脱屑患者和健康人皮屑内酸性磷酸酶活性和酸性磷脂酶A2活性和反映表皮屏障功能的转谷氨酰胺酶1活性等探讨正常/异常脱屑的机理。本研究采取板层鱼鳞病（LI）和寻常银屑病（PV）患者的鳞屑铺片标本,以健康人为对照,应用组织/细胞化学方法进行转谷氨酰胺酶1活性,酸性磷酸酶活性和酸性磷脂酶A2活性检测,进一步探讨表皮脱屑的机理。并对LI志愿者（对个别重度LI患者进行TGase 1基因测序）的局部皮肤每日一次施以低浓度的乙醇酸-甘油,对异常脱屑（呈片状磷屑）患者进行初步疗效观察,为异常脱屑患者的临床治疗提供实验基础。材料与方法1.采集标本对10例LI患者（4例重度,4例中度及2例轻度）,10例寻常型银屑病患者和10例健康志愿者收集皮屑标本,低温保存。另对一例重症LI患者抽取10ml静脉血用枸橼酸钠抗凝后送基因公司检测TGM1基因序列。2.不同浓度乙醇酸对不同程度的异常脱屑LI患者的应用方式以乙二醇为溶剂,36%的乙醇酸为溶质,配成不同浓度的乙醇酸溶液。对重度LI患者应用终浓度3-4%的乙醇酸-甘油（50%甘油）;对中、轻度LI患者应用1-2%的乙醇酸-甘油,每日一次局部外用,2周后观察照相。3.显示酸性磷酸酶活性对鳞屑铺片标本用10%的福尔马林钙固定30min→底物孵育液（醋酸钠0.585g+双蒸水5ml→取2.5ml+1ml 8.5%NaCl+0.1N HCl+4ml双蒸水→取6ml+3.3%硝酸铅0.19ml+双蒸水16ml+3.2%beta甘油磷酸钠2ml+0.6%MgSO4 0.5ml以1N HCl调至pH 5.6,用前过滤。）滴在玻片上,置37℃温箱4h→蒸馏水洗→1%醋酸作用30s→蒸馏水洗3次→2%（NH4）2S 1-2min流水→洗5min→显微镜下观察照相（同时做不加底物培育的阴性对照）。4.TGase 1酶活性的检测首先制备鳞屑铺片标本和HRP（辣根过氧化物酶）—单丹酰偶联物（HRP-MDC）;HRP-MDC的制备和检测TGase酶活性如下:①活化/氧化HRP以过碘酸活化/氧化HRP,4℃下以1mmol/L醋酸缓冲液透析过夜除去多余的NaIO4。②4mg单丹酰尸胺（mono-dansyl cadaverine,Sigma,US）溶于1ml PBS,与活化的HRP室温搅拌3h,形成偶联物。③加新配的0.05ml（4mg/ml）NaBH4（硼氢化钠,Sigma,US）,4℃反应2h,还原Schiff碱。④以HRP-MDC检测TGase酶活性:A液0.05mol/L Tris-HCl（pH8.0）,10 mmol/L CaCl2,1%BSA与B液HRP-MDC混合（1:1）,4℃过夜孵育各鳞屑铺片标本,DAB显色。⑤同时做不加底物孵育的阴性对照。⑥显微镜下观察,照相。5.显示酸性磷脂酶A2活性作用底物（1%卵磷脂水溶液10ml、2%氯化钙水溶液10ml、0.1M甘氨酸缓冲液,pH 5.5）→将底物滴在玻片上37℃浸渍15-36h→蒸馏水洗2-3min→加入胶体Nile蓝60℃染色30min→水沈2-3 min→显微镜下观察照相（同时做不加底物培育的阴性对照）。6.统计学分析实验数据应用图像分析仪（Shan Fu,China）扫描灰度均值（GSM）采用SPSS10.0统计学软件行单因素方差分析。实验数据以均数±标准差（（?）±s）表示,以α=0.05为检验显著性水准。结果1.一例重度L1患者的TGM1基因测序,显示TGase1基因突变主要为第Ⅲ外显子内第150位碱基（T）缺失,而导致移码突变。2.多数（80%）LI患者治疗,包括经TGM1基因测序的重度L1患者,1-4周后异常脱屑表型可获得一定改善。3.健康人ACPase酶活性呈黑色细颗粒主要定位于KC的细胞间桥,异常脱屑患者酶活性呈非特异的灰色,活性缺乏或缺如,很少见到细胞间桥处呈酶活性。4.健康人TGase 1酶活性呈棕色细颗粒定位于KC表面,异常脱屑患者酶活性皆缺乏或缺如。5.健康人APLase A酶活性呈兰色细颗粒定位于KC细胞间隙。异常脱屑患者酶活性皆缺乏或缺如。结论1.ACPase和APLPase A2酶参与脱屑过程,它们定位于角质形成细胞间隙,患者组中明显缺如。2.TGase 1酶定位于角质形成细胞的表面,参与角化膜套和类脂膜套的交联,患者组中明显缺如。3.低浓度的乙醇酸和甘油对症治疗鱼鳞病能明显改善板层鱼鳞病的表型,包括一例经TGM1基因测序的重度LI患者。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 论文 TGase 1,ACPase及APLPase A2酶活性参与脱屑机理和异常脱屑疗效的探讨
• 引言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附图
• 综述 有关正常脱屑与异常脱屑的研究进展
• 参考文献
• 后记
• 缩写词表
• 致谢