蛹虫草的家蚕人工培育及其ITS DNA序列分析

论文摘要

蛹虫草菌[Cordyceps militaris，(L．ex Fr．)Link．]也称北冬虫夏草、北虫草，其药用价值与驰名中外的冬虫夏草(Cordyceps sinensis)相似，为我国名贵的药用真菌。因虫草野生资源不断减少，致使虫草价格不断上涨，在国际市场上有很好的发展前景。目前，在国内外，对蛹虫草生物学特性、人工培育和应用价值等都有所研究，但在感染家蚕幼虫并成功培养出子实体的报道中，方法各异，子实体产率和稳定性不高，为此，我们作了如下研究：1．人工培养基上的试栽试验：首先筛选出了适合菌丝生长的优化培养基为加富PDA培养基。再通过在人工培养基上试栽试验，筛选出了适合其生长的较优条件和生长较好的菌株。2．蛹虫草感染家蚕的试验：通过对五龄家蚕幼虫的感染试验，筛选出了较优方法为表面消毒浸染法和孢子悬液注射法。同时对家蚕蛹进行了感染试验，得出感染效果较佳的条件。通过此试验筛选出了对家蚕幼虫和蛹感染效果较好的菌株为04718菌株。3．退化菌株复壮试验及菌株的ITS DNA分析：蛹虫草在试栽过程中经常会出现菌种退化的现象，针对此现象我们一方面作了部分菌种复壮试验，得出较好的方法为虫体回接法；另一方面采用核酸序列分析方法，扩增并测序了16个供试菌株的ITS区段，系统分析表明，复壮菌株与退化菌株在分子水平上发生了较大改变，复壮之后与未发生退化菌株具有较大相似性。并通过系统树分析了各供试株之间的亲缘关系和系统演化。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言与综述
• 1. 蛹虫草的分类及分布
• 2. 蚕蛹虫草的人工培育
• 2.1 菌种
• 2.2 接种方法
• 2.3 消毒方法
• 2.4 接种蚕龄
• 3. 蚕蛹虫草的成分分析
• 3.1 虫草素
• 3.2 核苷类化合物
• 3.3 多糖
• 3.4 氨基酸
• 3.5 无机元素
• 4. 蚕蛹虫草的毒理特性
• 5. 蚕蛹虫草的药理作用
• 5.1 蚕蛹虫草的延缓衰老作用
• 5.2 家蚕蛹虫草的抗肿瘤作用
• 5.3 蚕蛹虫草对免疫调节的影响
• 5.4 其它作用
• 6. 展望
• 第二章 蛹虫草人工培养基和培育条件的研究
• 第一节 蛹虫草菌丝生长的研究
• 1 试验材料
• 2 试验方法
• 3 结果与分析
• 3.1 蛹虫草菌丝生长的研究
• 3.2 蛹虫草菌丝在不同培养基上生长速度的比较
• 3.3 不同蛹虫草菌株在不同培养基上产分生孢子数量的比较
• 4 讨论
• 第二节 米饭培养基上菌株的筛选
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2. 结果与分析
• 第三节 蛹虫草与红曲固体协同发酵
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2. 结果与分析
• 2.1 拮抗试验
• 2.2 协同发酵
• 3. 讨论
• 第四节 蛹虫草人工培育的条件探索
• 1. 材料
• 2. 方法
• 3. 结果与分析
• 4. 小结与讨论
• 第五节 蛹虫草产多糖的初步研究
• 1 材料和试剂
• 1.1 实验材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器设备
• 2 实验方法
• 2.1 标准曲线制作
• 2.2 蛹虫草多糖的提取
• 2.2.1 水提法
• 2.2.2 微波助提法
• 2.3 粗多糖的测定
• 3 结果与分析
• 3.1 葡萄糖标准曲线
• 3.2 粗多糖测定
• 4 小结与讨论
• 第三章 家蚕活体上蛹虫草培育的研究
• 第一节 蛹虫草菌感染五龄桑蚕的试验
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 供试菌株
• 1.1.2 供试桑蚕
• 1.1.3 供试培养基
• 1.2 方法
• 1.2.1 培养基制备
• 1.2.2 菌种活化
• 1.2.3 感染试验
• 1.2.4 浸染后的培养
• 2 结果与分析
• 2.1 不同感染方法对菌株感染的影响
• 2.2 不同菌株感染能力的方差分析
• 2.3 不同菌株感染能力的SSR检验
• 2.4 家蚕被感染后菌丝15天生长情况统计
• 2.5 不同方法对子实体产量的影响
• 2.6 不同菌株子实体产量的方差分析
• 2.7 不同菌株子实体产量的SSR检验
• 3 讨论
• 第二节 蛹虫草菌感染家蚕蛹的试验
• 1. 材料
• 2. 方法
• 2.1 浸染法
• 2.2 注射法
• 3. 菌丝期培育管理试验
• 4. 结果与分析
• 4.1 感染方法
• 4.2 菌丝期培育管理试验
• 4.3 04718菌株子实体生长情况
• 5. 讨论
• 第四章 退化菌株的复壮试验
• 1. 试验方法
• 1.1 组织分离法
• 1.2 孢子分离法
• 1.3 虫体回接法
• 1.4 菌丝生长试验
• 1.5 子实体栽培
• 2. 结果与分析
• 2.1 菌丝生长情况
• 2.2 子实体栽培试验
• 3. 小结与讨论
• 第五章 菌株ITS DNA序列分析
• 1. 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 仪器和试剂
• 1.3 菌丝体培养
• 1.4 基因组DNA的提取和纯化
• 1.4.1 试剂配制
• 1.4.2 基因组DNA的提取
• 1.5 DNA纯度的检测
• 1.5.1 紫外光吸收检测
• 1.5.2 琼脂糖凝胶电泳检测
• 1.6 多聚酶链式反应（PCR扩增）
• 1.6.1 本实验所用引物
• 1.6.2 扩增条件
• 1.6.3 扩增产物检测
• 1.7 扩增产物的纯化及序列的测定
• 1.8 扩增产物纯化
• 1.9 纯化产物检测
• 1.10 纯化产物序列测定
• 1.11 基于扩增序列的系统分析
• 2. 结果与分析
• 2.1 基因组DNA的提取
• 2.2 ITS区段的PCR扩增
• 2.3 PCR扩增产物的序列测定
• 2.4 在GENBANK上的搜索（BLAST）结果
• 2.5 基于ITS区段的序列分析
• 3. 讨论
• 3.1 基因组DNA的提取
• 3.2 ITS DNA序列分析
• 参考文献
• 致谢
• 附录