论文摘要
免疫球蛋白（Immunoglobin, Ig）是代表机体体液免疫功能的一项重要指标,在体内承担免疫调节作用,开发的产品已被用于治疗免疫相关疾病。Ig具有由2条重链和2条轻链构成的“Y”型结构,顶端的可变区是Ig主要活性区域。真菌免疫调节蛋白（Fungal immunomodulatory protein, FIP）是从真菌中分离的一类结构与Ig重链可变区结构极其相似而且具有免疫调节功能的小分子蛋白质。目前已发现7种FIPs,其中来源于金针菇的免疫调节蛋白（FIP from Flammulina velutipes, FIP-fve）经研究具有免疫调节作用,具有激活T淋巴细胞产生细胞因子、预防治疗哮喘、鼻炎、湿疹等过敏症和抑制癌细胞生长等生物活性。本研究通过RT-PCR方法获得FIP-fve cDNA序列,构建克隆载体pUC19-FIP-fve和表达载体pET30a （+）-FIP-fve,后者经酶切鉴定和测序后热激法转入大肠杆菌Transetta（DE3）并进行重组蛋白表达研究。确定了重组菌株高效可溶性表达条件为28℃,0.2mM IPTG诱导培养24h,表达率为30%以上。优化的菌体裂解方法为超声波法（200w,5s,30min）结合溶菌酶法,菌体裂解率达98%以上。采用镍离子亲和树脂建立柱式规模化纯化工艺获得单一蛋白,使His-FIP-fve产率达29.1mg/L,纯度97%以上,经研究冻干工艺获得了形态稳定、溶解性好、可用于注射的His-FIP-fve冻干粉针剂型。通过圆二色谱（CD）测定His-FIP-fve二级结构,结果表明其在大肠杆菌Transetta（DE3）中得到了正确折叠和有效表达,形成了具有低含量α-螺旋（15%）和高含量p-折叠（38%）的二级结构,并且具有少量β-转角结构,相应比例和天然蛋白相似,证明重组蛋白从二级结构上具备了有生物学活性的前提条件。研究了重组蛋白的体内生物学活性,通过ELISA实验研究了His-FIP-fve对小鼠血清中三种细胞因子（IL-2. IL-4和IFN-y）含量的影响。结果：低剂量组（5mg/kg）小鼠血清中IL-2和IFN-γ的含量最高,与空白对照组比较差异极显著（p<0.01）；各剂量组对小鼠血清中IL-4含量影响与空白对照组比较差异不显著（p>0.05）,表明重组His-FIP-fve具有促进小鼠体内产生IL-2和IFN-y的活性,而对IL-4水平无显著影响。同时通过RT-PCR方法研究发现His-FIP-fve能够诱导细胞因子IFN-y和IL-2基因的表达。此外,通过其他原核表达载体表达了FIP-fve。构建了原核表达载体pGEX4t-1-FIP-fve并诱导表达,利用Gst亲和层析柱对表达产物进行了纯化,融合蛋白产率为5.8mg/L。并用凝血酶切割掉Gst标签,得到了单纯FIP-fve蛋白。该表达率较低,工艺较复杂,表达产物活性还需进一步研究。目前对该蛋白的研究主要集中在结构、功能和免疫调节机制等方面,对其表达特性及其表达调控机制的研究还未见报道,本研究立足于品种改良基础理论研究及蛋白表达特性研究,对金针菇8个品种进行栽培和液体发酵,获得了金针菇子实体和菌丝体样本；筛选内参基因,通过荧光定量PCR技术（Real-time PCR）了解不同品种、同一品种子实体菇盖,菇柄中段,茹柄基部以及液体发酵菌丝体中FIP-fve转录水平。结果：不同品种中FIP-fve基因转录水平不同,白色品种略高于黄色品种；菇柄中部高于菇柄基部,而在菇盖中的表达水平略低；幼嫩的菇蕾低于成熟子实体。同时,以纯化的His-FIP-fve为抗原免疫新西兰大耳白兔,制备了效价高达1：128,000且特异性良好的兔抗His-FIP-fve多克隆抗体；通过免疫印迹法研究FIP-fve基因在不同品种、菇体发育不同阶段、不同部位及菌丝体中的蛋白表达情况。Western-blot实验结果：FIP-fve基因在白色品种表达量比黄色品种略高；菇柄中部和基部比菇盖略高；菌丝体中基本不表达成蛋白质；幼嫩的菇蕾中FIP-fve表达量低于成熟子实体。本研究优化了重组FIP-fve表达和纯化技术,获得重组His-FIP-fve大量表达和规模化生产工艺,通过动物体内活性试验研究了重组蛋白的活性特征,证实其具有和天然蛋白相类似的生物学活性,并研究了天然蛋白的表达特性。本研究为深入研究金针菇免疫调节蛋白的作用机制并促进重组蛋白在抗过敏、抗肿瘤和医药保健等方面的产品开发奠定研究基础。
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标签：金针菇免疫调节蛋白论文; 重组蛋白论文;