水稻苗期低温失绿基因的精细定位和功能初步分析

论文摘要

水稻苗期低温失绿是一个重要的突变性状,研究该性状的遗传基础在理论上和应用上都具有重要的意义。本实验室前期研究发现,水稻品种Dular苗期叶色受温度影响。在早季低温条件下,Dular幼苗表现出白化失绿,叶绿体不能正常发育。光照培养箱低温试验表明,其失绿的临界温度为2023℃。遗传分析表明,该低温失绿受隐性单基因cisc（t）控制,已将该基因定位在9号染色体两个SSR标记RM257与RM242之间。在此基础上,本研究对Dular幼苗低温敏感的时期和外源脱落酸（ABA）对幼苗低温敏感性的影响进行分析,对苗期低温失绿基因进行精细定位,并对候选基因进行初步的生物信息学分析和半定量RT-PCR分析,以期为基因的克隆、功能分析以及阐明植物耐冷分子机制奠定基础。主要结果如下:（1）Dular幼苗在两叶期以前低温处理表现为白化或部分白化,三叶期以后低温处理则基本为绿色。持续低温试验表现为前2叶全部白化,第3叶长出时开始转绿,到5叶期大部分转绿。可见Dular幼苗对低温敏感主要在两叶期以前,而到三叶期时对低温已不敏感,具有一定的耐冷性。（2）低温条件下施加外源ABA可以减弱Dular幼苗的白化程度,提高其耐冷性。随着ABA浓度的升高,幼苗的白化程度逐渐降低。当ABA浓度大于0.4μM时,幼苗恢复绿色,但植株矮化,生长受到抑制。由此推测控制幼苗低温失绿的基因很可能是与ABA途径有交叉的冷响应途径中的一个关键基因。（3）在前期定位的基础上开发出新的SSR标记和InDel标记,利用Lemont/Dular、Ⅱ-32B/Dular的两个F2群体中的800个低温白化单株进行基因定位,将该基因定位在标记InDel13-2与InDel11之间的88 kb范围内。（4）在88kb定位区间内共有13个基因。有2个基因编码的蛋白存在叶绿体前导肽,与叶绿体有关,故可作为候选基因。另外,对3个基因（2个为bZIP和bHLH类型转录因子,1个为编码磷脂酰肌醇的PHIN基因）在低温处理下进行RT-PCR半定量分析,结果显示:随着处理时间的延长,bZIP和PHIN表达量先增强后减弱,而bHLH持续增强,但差异不太明显。说明这3个基因均与冷胁迫相关,都是可能的候选基因。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 文献综述
• 1 植物耐冷性研究进展
• 1.1 植物耐冷性的生理研究
• 1.1.1 拟南芥及其他作物的耐冷性研究
• 1.1.2 水稻的耐冷性研究
• 1.1.3 低温胁迫与ABA
• 1.2 水稻耐冷性的遗传研究
• 1.2.1 芽期
• 1.2.2 苗期
• 1.2.3 开花期
• 1.2.4 孕穗期
• 1.3 植物耐冷性的分子生物学研究
• 1.3.1 植物耐冷功能基因
• 1.3.2 植物冷驯化过程中的基因转录途径
• 1.3.3 ABA 与植物低温信号转导
• 2+与植物低温信号转导'>1.3.4 Ca²⁺与植物低温信号转导
• 2 植物叶色相关突变体的研究进展
• 2.1 叶色突变体的分类
• 2.2 叶色突变体的遗传模式
• 2.3 水稻叶绿素合成缺陷突变基因及定位
• 2.4 叶色突变的分子机理
• 2.5 叶色突变体的应用
• 3 分子标记技术及其在水稻上的应用
• 3.1 分子标记概述
• 3.2 分子标记技术
• 3.2.1 以传统的Southern 杂交为基础的分子标记技术
• 3.2.2 基于PCR 技术的分子标记
• 3.3 分子标记在水稻研究中的应用
• 3.3.1 水稻分子遗传图谱的构建
• 3.3.2 水稻基因的标记及克隆
• 3.3.3 比较基因组学研究
• 3.3.4 分子标记辅助育种
• 3.3.5 DNA 分子标记育种应用前景
• 第一章 水稻苗期低温失绿的表型分析及与ABA 的关系
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 Dular 播种后不同时期低温处理下的叶色观察
• 1.2.2 低温条件下Dular 幼苗的ABA 处理
• 2 结果与分析
• 2.1 DULAR 幼苗对低温的敏感时期
• 2.2 外源ABA 对DULAR 低温失绿的影响
• 3 讨论
• 3.1 水稻苗期低温失绿品种DULAR 的表型及其来源
• 3.2 外源ABA 对水稻苗期低温失绿品种DULAR 的影响
• 第二章 水稻苗期低温失绿的精细定位及候选基因的初步分析
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 DNA 样品制备
• 1.2.2 SSR 和InDel 标记开发
• 1.2.3 PCR 与电泳分析
• 1.2.4 数据统计与连锁分析
• 1.2.5 目的区域基因的生物信息学分析
• 1.2.6 耐冷相关基因的表达分析
• 2 结果与分析
• 2.1 CISC（T）基因的精细定位
• 2.2 候选基因初步的生物信息学分析
• 2.3 定位区间内预测基因的RT 半定量表达分析
• 2.3.1 RNA 质量检测
• 2.3.2 半定量RT-PCR 结果
• 3 讨论
• 3.1 水稻苗期低温失绿基因的精细定位
• 3.2 半定量RT-PCR 表达分析候选基因
• 3.3 水稻苗期低温失绿基因CISC（T）在生产育种中的应用
• 展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢