基于人工抗体的内毒素快速检测方法研究

论文摘要

内毒素广泛存在空气、土壤和水等环境介质中。被内毒素污染的水进入人体后,小剂量的内毒素（1-5ng/kg体重）即可引起体温上升,产生内毒素休克,播散性血管内凝血等症状,严重威胁人群健康。内毒素不易被加热、氯化消毒破坏,因此,实时监测水环境中的痕量内毒素十分重要。人工抗体（又称分子印迹聚合物,MIP）可特异性识别和结合靶分子,能够代替天然抗体,与酶联免疫（ELISA）和表面等离子共振（SPR）技术联用,建立快速测定内毒素的新方法,用于实时监测水环境中的内毒素。本研究主要包括下述两个部分：第一部分人工抗体-酶联免疫法检测痕量内毒素目的：将MIP与ELISA联用,建立集特异性样品预处理和ELISA检测于一体的人工抗体-酶联免疫法（MIP-ELISA）,检测环境水样品中痕量内毒素。方法：以多巴胺为功能单体,内毒素为模板分子,在酶标板上合成MIP。将该MIP作为包被抗体,特异性分离富集样品中的痕量内毒素,然后加入兔抗内毒素多克隆抗体,与MIP结合的内毒素形成抗原-抗体结合物,再加入酶标二抗,最后加入发光底物,利用增强化学发光法（ECL）测定内毒素含量。对MIP-ELISA检测内毒素的灵敏度,线性范围,稳定性及特异性进行评价,并利用MIP-ELISA检测自来水、江水和医院污水中痕量的内毒素。结果：在直接上样100μL时,MP-ELISA检测内毒素的灵敏度为10ng/mL,线性范围为10ng/mL～100ng/mL,对内毒素加标（10-100ng/mL）的江水样品回收率在83.6%～101.7%,日内和日间偏差均小于5%（n=6）。MIP-ELISA测定革兰氏阴性菌——大肠杆菌、明亮发光杆菌和绿脓杆菌（菌液浓度为105cfu/mL）中的内毒素浓度分别为99.15±2.79ng/mL,112.63±3.68ng/mL,113.74±3.58ng/mL,革兰氏阳性菌——金黄色葡萄球菌（菌液浓度为105cfu/mL）的检测结果为阴性,测定自来水,江水,医院污水中的内毒素浓度分别为18.2±2.6ng/mL,52.6±2.9ng/mL,99.3±1.8ng/mL。MIP-ELISA与标准方法（鲎试剂法）的检测结果相当（p>0.05）。结论：MIP-ELISA对内毒素的定量准确,可靠,能够用于环境水样品中痕量内毒素的检测。第二部分人工抗体-SPR法快速检测内毒素目的：将MIP与SPR联用,建立可快速检测内毒素的人工抗体-SPR法（MIP-SPR）。方法：以多巴胺为功能单体,内毒素为模板分子,在SPR芯片金膜表面合成MIP。将MIP-SPR芯片用于SPR仪,快速检测内毒素。对MIP-SPR检测内毒素的灵敏度,线性范围,稳定性及特异性进行评价,检测自来水、江水和医院污水中的内毒素含量。结果：MIP-SPR检测内毒素的线性范围为0.01～100ng/mL,灵敏度为0.01ng/mL,对内毒素加标（10～40ng/mL）的自来水样品回收率在86.9%～91.6%,日内和日间偏差均小于5%（n=6）。MIP-SPR测定革兰氏阴性菌——大肠杆菌、明亮发光杆菌和绿脓杆菌（菌液浓度为103cfu/mL）中的内毒素浓度分别为0.86±0.18ng/mL,0.73+0.13ng/mL,1.22±0.08ng/mL,革兰氏阳性菌——金黄色葡萄球菌（菌液浓度为103cfu/mL）的检测结果为阴性,测定自来水,江水,医院污水中的内毒素浓度分别为14.8±1.9ng/mL,50.1±2.2ng/mL,96.6±2.8ng/mL。MIP-SPR与标准方法（鲎试剂法）的测定结果相当（p>0.05）。结论：MIP-SPR对内毒素的定量准确,可靠,可直接用于环境水样品中内毒素的快速检测。

论文目录

• 中英文缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 人工抗体-酶联免疫法检测痕量内毒素
• 1前言
• 2试剂与材料
• 3方法
• 4结果与讨论
• 5结论
• 第二部分 人工抗体-SPR法快速检测内毒素
• 1前言
• 2试剂与材料
• 3方法
• 4结果与讨论
• 5结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 附录1 攻读学位期间完成的论文与成果
• 致谢