半枝莲黄酮改善复合Aβ25-35引起大鼠记忆障碍及其作用机制研究

论文摘要

阿尔茨海默病（alzheimer’s disease, AD）是一种以进行性记忆障碍为主要临床表现的神经退行性疾病,是老年期的常见病和多发病；目前世界面临着老龄化,AD发病率日益增多,因此,对AD的病理生理研究及治疗手段的探讨已成为国际医药界研究的热点。AD是多病因参与的神经系统发生病变的疾病,病因非常复杂,参与因素也非常多。病理上神经原丢失、胶质细胞增殖及相关物质的异常改变、神经递质及相关受体的减少、神经细胞内钙超载、细胞外β-淀粉样蛋白（beta-amyloids protein,Aβ）沉积形成的老年斑（senile plaque, SP）、细胞内tau蛋白过度磷酸化形成的大量神经纤维缠结（neurofibrillary tangle, NFT）、神经细胞凋亡以及神经炎症等都与AD发生密切相关,建立相应的体内/外拟AD模型,探讨其发病机制和治疗手段是非常必要的。经过长期的研究,已经知道,Aβ在脑内的沉积是AD发病的重要机制,脑室投放Aβ肽段可以诱发动物记忆障碍,如果结合铝和重组人类转化生长因子-β1（recombinant human transforming growth factor-β1, RHTGF-β1）建立多因素神经损伤拟AD模型,能更全面模拟人类AD病理生理特征,更贴近人类AD多因素致病特点。半枝莲黄酮（Scutellaria barbata flavonoids, SBF）是从半枝莲（Scutellaria barbata D.Don）地上部分分离的黄酮类化合物,以野黄芩苷为主。已经发现,SBF具有解热、抗菌、抗突变和抗氧化等多种功效,对去势大鼠记忆障碍和神经病理学改变具有明显的改善作用,但对Aβ25-35联合铝和RHTGF-β1拟AD模型相关研究未见报道。本研究利用脑室注射Aβ25-35联合三氯化铝（aluminium trichloride, AlC13）和RHTGF-β1建立拟AD模型,通过对该复合Aβ25-35模型大鼠学习记忆能力、神经病理学、神经胶质细胞及相关蛋白、线粒体凋亡通路中凋亡因子的检测,确定SBF改善该复合Aβ25-35所致大鼠记忆障碍和神经损伤的作用,以及其对系列分子综合调节的多途径、多靶点的作用机制。第一部分半枝莲黄酮对复合Aβ25-35所致大鼠记忆障碍和神经损伤的改善作用目的：利用大鼠脑室注射Aβ25-35联合AlC13和RHTGF-β1拟AD记忆障碍及神经损伤模型,检测SBF对该复合Aβ25-35所致大鼠记忆障碍及神经损伤的改善作用。方法：300-350g雄性SD大鼠,手术前在二级动物实验室适应性饲养1w。手术第1d脑室注射RHTGF-β11μl（10ng）,手术第2d侧脑室注射Aβ25-354μg/d和1%AlCl33μl/d,上午注射Aβ25-35,连续注射14d；下午注射溶液AlCl3,连续5d;假手术对照组大鼠做同样手术,但脑室注射等体积的生理盐水。大鼠在手术后第45d采用Morris大鼠水迷宫进行记忆障碍模型成功筛选,利用每只注射复合Aβ25-35大鼠和假手术组大鼠第4d水迷宫游泳成绩计算模型成功筛选率（screening ratio,SR）,当某只大鼠SR大于0.2时,该只大鼠即为记忆障碍模型成功大鼠。在动物手术第49d,所有记忆障碍模型成功大鼠随机分4组：模型对照组和SBF三个剂量组。SBF三个剂量组大鼠分别灌胃SBF35、70和140mg/kg38d,模型对照组和假手术对照组大鼠灌胃等体积的生理盐水。在给药第31d（即手术第79d）,所有大鼠进行Morris水迷宫记忆能力测试,连续测试7d。水迷宫测试的1、2d进行定位航行实验,检测大鼠对空间记忆获得能力；测试第3d撤去平台进行空间探索实验,检测大鼠记忆保持能力；测试第4、5和6d将平台放在目标象限对侧进行对侧实验,检测大鼠记忆再现能力；测试第7d将平台露出水面2cm,检测大鼠的游泳速度。在水迷宫结束后的第2d,所有大鼠在手术的第86d,即给药的第38d断头处死,肉眼大体观察大脑的组织学病理变化：苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining, HE）、硫瑾染色观察神经细胞形态学变化；电子显微镜观察神经细胞亚细胞结构变化。结果：大鼠在4d的水迷宫记忆障碍模型成功筛选中发现,所有大鼠在4d的训练中找到平台的潜伏期都随着训练天数的增加逐渐缩短,根据注射复合Aβ25-35的每只大鼠和假手术对照组大鼠,在水迷宫训练第4d找到平台的潜伏期所计算的SR值大于0.2,本实验大鼠记忆障碍模型成功率94.7%。在水迷宫定位航行实验中发现,模型对照组大鼠第1、2d找到平台的潜伏期比假手术对照组明显增加（P<0.01）；而SBF35、70和140mg/kg组大鼠与模型对照组相比可显著缩短大鼠找到平台的潜伏期（P<0.01）。在水迷宫空间探索实验中发现,模型对照组大鼠60s在目标象限（第一象限）的游泳时间、游泳路程和穿越次数比假手术对照组都明显减少（P<0.01）；而SBF三个剂量不同程度地逆转复合Aβ25-35所致大鼠上述异常改变,使注射复合Aβ25-35的大鼠60s在目标象限的游泳时间、游泳路程和穿越次数都不同程度地增加（P<0.05,P<0.01）。在水迷宫记忆再现能力测试中发现,与假手术对照组相比,模型对照组大鼠第4、5和6d找到平台的潜伏期显著延长（P<0.01）；而SBF个三剂量能显著缩短复合Aβ25-35所致大鼠找到平台潜伏期的延长（P<0.05,P<0.01）。水迷宫第7d检测各组大鼠游泳速度,发现各组大鼠找到平台的潜伏期没有明显区别,表明各组大鼠游泳速度接近,从而排除了大鼠由于游泳速度的差异而影响测试结果。在手术术后第86d,各组大鼠断头处死,肉眼观察到模型对照组大鼠脑组织明显病理学改变,脑质量降低,注射侧脑皮质表面发黄,部分鼠皮层塌陷变薄；HE和硫瑾染色光镜检测发现海马、皮层有的神经元数量明显减少,细胞肿胀,尼氏小体显著减少,有的出现典型的液化性坏死,坏死区神经元胞膜破裂、核溶解、大量炎性细胞浸润；电镜检测发现,模型对照组大鼠海马神经元固缩、核膜凹陷、核仁边移、常染色质变性凝聚、胞浆内核蛋白体解聚、有大量脂褐素、线粒体肿胀、内质网扩张,星型胶质细胞足突水肿、髓鞘板层破坏、鞘内轴索和髓神经纤维减退,突触前膜存在大量的兴奋性神经递质。然而,SBF35、70和140mg/kg灌胃38d,不同程度地逆转复合Aβ25-35所致大鼠上述神经病理学改变,使神经元数量及尼氏小体增多、未出现神经液化性坏死,也明显减轻海马神经亚细胞结构病理改变。结论：大鼠脑室注射Aβ25-35联合AlC13和RHTGF-p1可以出现记忆障碍和神经病理学改变,利用该模型发现SBF对该复合Aβ25-35所致大鼠记忆障碍和神经损伤具有显著的改善作用。第二部分半枝莲黄酮抑制复合Aβ25-35所致大鼠脑内Aβ和NFT的异常生成目的：利用复合Aβ25-35成功模型大鼠,确定复合Aβ25-35可以引起大鼠脑内Aβ和NFT异常生成。并通过SBF对脑内Aβ和NFT及相关分泌酶α-、β-和γ-的检测,阐明SBF通过抑制脑内Ap和NFT异常生成而发挥改善记忆障碍和神经损伤的作用机制。方法：所有大鼠末次给药60min断头处死,分离大脑。刚果红和硝酸银染色分别检测脑内Ap和NFT；实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction, qPCR）检测皮层α-、β-和γ-分泌酶mRNA的表达。结果：与假手术对照组相比,模型对照组大鼠Aβ刚果红染色和硝酸银染色NFT细胞数量明显增多（P<0.01）；且皮层中聚集NFT的细胞呈现神经原纤维增粗、紊乱,遍布全部细胞质并深入细胞突起,形成染色较深的拖尾状。SBF35、70和140mg/kg灌胃38d不同程度地抑制复合Aβ25-35所致大鼠脑内Ap和NFT异常生成,与Aβ对照组相比,SBF35、70和P140mg/kg组大鼠脑内Ap和NFT细胞数都明显减少（P<0.05,P<0.01）。qPCR检测大鼠皮层α-、β-和γ-分泌酶发现,与假手术对照组相比,模型对照组皮层β-分泌酶和γ-分泌酶mRNA表达分别增加（P<0.01）和降低（P<0.05）。然而,SBF70和140mg/kg明显逆转复合Aβ25-35所致大鼠皮层p-分泌酶mRNA表达的增加（P<0.01）,SBF35和140mg/kg使γ-分泌酶的mRNA表达进一步降低（P<0.05,P<0.01）。结论：大鼠脑室注射复合Aβ25-35可以引起脑内Ap和NFT异常生成,增加脑内β-分泌表达,降低γ-分泌酶的表达。而SBF能够抑制脑内Ap和NFT异常生成,调节β/γ-分泌酶表达,表明,SBF改善复合Aβ25-35所致大鼠记忆障碍及神经损伤,部分地是通过抑制脑内Aβ和NFT异常生成而完成的。第三部分半枝莲黄酮抑制复合Aβ25-35所致大鼠脑内神经胶质细胞的增殖与活化目的：利用复合Aβ25-35成功模型大鼠,确定复合Aβ25-35可以引起大鼠脑内胶质细胞异常增殖与活化。并通过胶质细胞数量及其活化相关蛋白的检测,确定SBF通过抑制复合Aβ25-35所致大鼠脑内胶质细胞异常增殖与活化而发挥改善记忆障碍和神经损伤的作用机制。方法：所有大鼠末次给药60min断头处死,分离大脑。碳酸银染色测定小胶质细胞（microglia, MG）的数量；免疫组化法测定星形胶质细胞（astrocyte, AS）数量、神经元型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase, nNOS）和诱导型一氧化氮合酶（induced nitric oxide synthase, iNOS）的蛋白表达；qPCR法测定内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase, eNOS） mRNA的表达；免疫印迹（western blotting）法测定胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）、白细胞共同抗原（leukocyte common antigen, CD45）、热休克蛋白70（heat shock protein, HSP70）的蛋白表达;RT-PCR法测定ApoE mRNA的表达;ELISA法测定海马、皮层和纹状体中白介素-1β（interleukin-1beta,IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha, TNF-α）、IL-6、IL-8和IL-10的水平。结果：与假手术对照组相比,模型对照组大鼠脑内AS和MG数、GFAP/CD45/HSP70（?）PiNOS的蛋白表达以及ApoE和eNOS mRNA的表达都明显增加（P<0.01）；nNOS蛋白表达明显降低（P<0.01）;海马、皮层和纹状体中IL-1β和IL-10的水平显著降低（P<0.01）,TNF、IL-6和IL-8的水平显著升高（P<0.01）。然而,SBF35、70和140mg/kg不同程度地逆转复合Aβ25-35所致大鼠脑内上述异常改变。结论：复合Aβ25-35可以引起大鼠脑内胶质细胞异常增殖、以及其活化相关蛋白GFAP、CD45、HSP70、ApoE和NOS异常表达,引起脑内IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8和IL-10水平异常变化。SBF可以逆转复合Aβ25-35所致大鼠上述异常变化。提示,SBF改善复合Aβ25-35所致大鼠记忆障碍和神经损伤,可能源于其抑制神经胶质细胞异常增殖与活化而完成的。第四部分半枝莲黄酮正向调节复合Aβ25-35所致大鼠脑内线粒体凋亡通路异常目的：利用复合Aβ25-35成功模型大鼠,确定复合Aβ25-35能引起大鼠神经细胞线粒体凋亡通路中凋亡因子B细胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma-2, BCL-2）、BCL-2相关X蛋白（BCL-2associated X protein, BAX）和半胱天冬蛋白酶-3（cysteinyl aspartate specific proteinase-3, Caspase-3）异常表达,并通过对上述凋亡因子的检测,确定SBF通过正向调节神经细胞线粒体凋亡通路中凋亡因子,而实现改善复合A β25-35所致大鼠记忆障碍和神经损伤的分子机制。方法：所有大鼠末次给药60min断头处死,分离大脑。Western blotting测定大鼠皮层BCL-2和BAX蛋白表达,qPCR法测定Caspase-3mRNA表达。结果：复合Aβ25-35可以引起大鼠神经细胞凋亡因子BCL-2、BAX和Caspase-3异常改变,与假手术对照组相比,模型对照组大鼠皮层中BCL-2蛋白表达显著降低（P<0.05,P<0.01）,BAX蛋白表达和Caspase-3mRNA表达明显增加（P<0.05,P<0.01）。然而,SBF35、70和140mg/kg不同程度地逆转复合Aβ25-35所致大鼠神经细胞凋亡因了的异常表达,与模型对照组相比,SBF三个剂量组BCL-2蛋白表达明显增加（P<0.05,P<0.01）、BAX蛋白表达和Caspase-3mRNA表达都明显降低（P<0.05,P<0.01）。结论：复合A β25-35可以引起大鼠神经细胞线粒体凋亡通路中凋亡因子BCL-2、BAX和Caspase-3异常表达,而SBF三个剂量不同程度地逆转复合Aβ25-35所致大鼠神经细胞上述异常改变。提示,SBF改善复合Aβ25-35所致大鼠记忆障碍和神经损伤是通过正向调节脑内线粒体凋亡通路异常。全文结论脑室注射AP25-35联合AlC13和RHTGF-β可以使大鼠可以出现记忆障碍和标志性神经病理学改变。利用该模型,本研究进一步发现,SBF对该复合Aβ25-35所致大鼠记忆获得、记忆保持和记忆再现障碍,以及神经病理学改变都有显著的改善作用。其作用机制可能是通过抑制脑内Aβ和NFT异常产生、抑制脑内神经胶质细胞增殖与活化以及正向调节神经细胞线粒体凋亡通路而实现的。本研究提示,SBF对系列分子综合调节作用是有效改善记忆障碍、神经损伤和抗AD作用的基础,为此阐明了SBF的抗痴呆、改善记忆障碍和神经损伤的作用以及多途径、多靶点的作用机制。

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第一部分 半枝莲黄酮对复合Aβ25-35所致大鼠记忆障碍和神经损伤的改善作用
• 第二部分 半枝莲黄酮抑制复合Aβ25-35所致大鼠脑内Aβ和NFT的异常生成
• 第三部分 半枝莲黄酮抑制复合Aβ25-35所致大鼠脑内神经胶质细胞增殖与活化
• 第四部分 半枝莲黄酮正向调节复合Aβ25-35所致大鼠脑内线粒体凋亡通路异常
• 全文小结
• 参考文献
• 附图
• 综述
• 参考文献
• 攻博期间发表的科研成果
• 后记