海洋微生物产壳聚糖酶基因的克隆和表达载体构建

论文摘要

壳聚糖酶（Chitosanase EC 3.2.1.132）能催化壳聚糖中糖苷键的水解生成壳寡糖,壳寡糖被广泛应用在医药、保健品、食品、生物控制剂等方面,利用基因工程构建高产壳聚糖酶的工程菌对相关工业具有深远的意义。本实验从大连周边海域的海泥中筛选出两株壳聚糖酶产生菌,通过对其进行分子生物学鉴定,从中克隆壳聚糖酶基因,构建了其大肠杆菌表达载体,为其高效表达奠定了基础。主要结论包括：1.从大连周边海域的海泥中筛选出两株壳聚糖酶产生菌,16S rDNA比对确定一株细菌为芽孢杆菌属,且与炭疽杆菌亲缘关系较近。2.设计一对特异引物,从炭疽杆菌W-2 （Bacillus authracis strain W-2）的基因组中克隆得到了一段约500bp的片段,将该片段与pMD20-T载体连接后转化至大肠杆菌DH5a中,经对重组质粒进行鉴定及测序,该片段为一486bp的壳聚糖酶基因片段chiW。并与NCBI上已发布的芽孢杆菌属壳聚糖酶编码区序列进行比对分析。结果表明,该片段与来自糖苷水解酶46家族中的Bacillus subtilis和Bacillus sp. KFB-CO4的壳聚糖酶编码区序列一致性分别为41.75%和45.93%；与糖苷水解酶8家族中的Bacillus sp.No.S-1的壳聚糖酶编码区序列一致性为52.91%。因而初步推断该片段为类似壳聚糖酶基因片段。将chiW克隆到pET28a载体中,构建重组表达质粒,转化至感受态大肠杆菌BL21（DE3）中,IPTG诱导其表达。利用SDS-PAGE电泳分析表达的蛋白质的分子量约为66.4KD与43.3KD之间的表达蛋白。3.对chiW的生物信息学分析表明,其拟表达蛋白质的分子式为C809H1181N201O209S13,分子量计算值为17,483.2Da,理论等电点为8.63,其N-末端为Met是疏水性稳定蛋白,α-螺旋占21.48%、p-折叠占38.93%、无规则卷曲占39.06%

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 壳聚糖
• 1.2 壳聚糖酶的研究进展
• 1.3 壳聚糖酶的分类
• 1.4 壳聚糖酶的分子生物学特征
• 1.5 壳聚糖及壳聚糖酶的应用
• 1.5.1 应用于基础生物学的研究
• 1.5.2 抑菌方面的应用
• 1.5.3 在生物控制剂方面的应用
• 1.5.4 在医学抗肿瘤方面的应用
• 1.5.5 在食品保健领域的应用
• 1.6 壳聚糖酶分子生物学研究展望
• 1.7 本课题的目的及研究意义
• 1.8 实验流程
• 第二章 目的菌株的分子生物学鉴定
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 目的菌株
• 2.1.2 试剂盒与酶
• 2.1.3 常用试剂
• 2.1.4 主要仪器
• 2.1.5 常用培养基及试剂的配制
• 2.1.5.1 常用培养基配置
• 2.1.5.2 常用试剂的配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 培养条件
• 2.2.2 基因组DNA的提取
• 2.2.3 琼脂糖凝胶电泳检测
• 2.2.3.1 琼脂糖凝胶的制作
• 2.2.3.2 琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.4 目的菌株16S rDNA的扩增
• 2.2.5 16S rDNA的测序及鉴定
• 2.3 结果与分析
• 第三章 壳聚糖酶基因片段的克隆及鉴定
• 3.1 材料与试剂
• 3.1.1 菌株和载体
• 3.1.2 试剂盒与酶
• 3.1.3 常用试剂
• 3.1.4 主要仪器
• 3.1.5 主要培养基及试剂的配制
• 3.1.5.1 常用培养基配置
• 3.1.5.2 常用试剂的配制
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 特异性引物设计
• 3.2.2 PCR扩增目的酶基因片段
• 3.2.2.1 退火温度的初步优化
• 3.2.2.2 PCR扩增
• 3.2.3 PCR产物的回收
• 3.2.4 目的片段与pMD20-T载体的连接反应
• 2法）'>3.2.5 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备（CaCl₂法）
• 3.2.6 重组质粒的转化
• 3.2.7 重组质粒的菌落PCR鉴定
• 3.2.8 重组质粒的抽提
• 3.2.9 双酶切反应
• 3.3 结果与分析
• 第四章 目的基因片段的测序及分析
• 4.1 实验方法
• 4.1.1 目的基因片段的测序
• 4.1.2 序列分析
• 4.2 序列分析及拟表达蛋白预测结果
• 4.2.1 B-2中目的片段的测序结果
• 4.2.2 进化树构建
• 4.2.3 chiW的蛋白性质与结构预测
• 4.2.3.1 chiW序列的复杂度与稳定性
• 4.2.3.2 chiW拟翻译成氨基酸序列
• 4.2.3.3 chiW蛋白质性质的预测
• 4.2.3.4 chiW蛋白质二级结构的预测
• 4.2.3.5 信号肽预测
• 4.2.3.6 拟编码蛋白的疏水性分析
• 4.2.3.7 跨膜结构的预测和分析
• 4.2.3.8 磷酸化位点的预测
• 第五章 chiW基因的表达载体构建
• 5.1 材料
• 5.1.1 菌株与质粒
• 5.1.2 主要试剂
• 5.1.3 主要实验仪器
• 5.1.4 主要试剂配制
• 5.2 方法
• 5.2.1 引物合成
• 5.2.2 PCR反应
• 5.2.3 质粒pET28a的提取
• 5.2.4 双酶切反应
• 5.2.5 酶切产物回收
• 5.2.6 BL21感受态细胞的制备
• 5.2.7 连接反应
• 5.2.8 转化
• 5.2.9 鉴定
• 5.2.10 目的蛋白片段的诱导表达
• 5.2.11 SDS-PAGE电泳
• 5.3 结果
• 5.3.1 空载质粒pET28a和表达载体构建流程
• 5.3.2 PCR扩增
• 5.3.3 质粒pET28a和PCR产物的酶切反应
• 5.3.4 目的片段的诱导表达
• 第六章 结论
• 参考文献
• 致谢