论文摘要
目的:从建立表皮细胞去分化模型入手,比较去分化来源的表皮干细胞和机体自身来源的表皮干细胞在功能和生物学特性等方面的异同点,为实现无延迟、无瘢痕完美修复及皮肤组织的再生提供新的实验参考。方法:采用免疫组织化学的方法探寻胎儿皮肤中的表皮干细胞（epidermal stemcells,ESCs）,研究不同发育时期ESCs在胎儿皮肤中分布与迁移。采用改良的Ⅳ型胶原铺板选择黏附法分离培养人ESCs,观察其形态及增值分化的特点,并进行细胞免疫组织化学鉴定。同时,提取小鼠胚胎发育中期组织液,模拟表皮干细胞壁龛微环境,采用免疫组织化学、免疫荧光染色、流式细胞检测及RT-PCR技术研究表皮干细胞在此环境中的表型变化,探讨表皮干细胞周围生长微环境在表皮干细胞“命运”决定过程中的作用。此外,本研究在前期的工作基础上,建立表皮细胞去分化研究的体内、体外实验模型,采用免疫组织化学、MTT法、免疫荧光染色、流式细胞技术、扫描及透射电镜检测技术、RT-PCR、Western-blot及TRAP法再次验证表皮细胞通过去分化途径形成机体内源性去分化来源的表皮干细胞,参与皮肤组织的创伤修复与再生。同时,从细胞表型、超微结构及生物学功能等方面比较去分化来源的表皮干细胞和机体自身来源的表皮干细胞二者之间的异同点。结果:表皮干细胞在从基底层经棘层和颗粒层到角质层的分化迁移过程中,经历了有序的成熟模式,这一过程与角蛋白的程序性表达密切相关;毛囊的发生、发育不仅与ESCs的增殖分化有关,同时受到毛乳头的诱导作用。改良的Ⅳ型胶原选择黏附法能够高效的分离表皮中的干细胞。这些细胞具有干细胞的形态特点表达α6整合素,β1整合素,CK19,CK14,p63,Nestin及PCNA为阳性,而CK10染色为阴性;激光共聚焦检测显示α6整合素和CD71在表皮干细胞中的分布存在着区域性差异,可以作为区分标志之一,为ESCs及其亚群的分离与鉴定提供实验参考。此外,流式细胞检测显示胚胎组织提取液作用后α6+CD71-表达细胞由细胞总数的22.49%减少至10.92%,而α6+CD71+、α6-CD71+表达细胞则分别由诱导前的62.29%及0.19%增加至诱导后的68.34%及4.51%。RT-PCR结果表明胚胎组织提取液作用后,表皮干细胞中β1整合素、CKl9、CK10表达增强,而CK14表达减弱。本文在前期工作的基础上,建立了表皮细胞去分化研究的体内、体外实验模型,免疫组织化学染色结果显示去基底层的超薄皮片CK19和β1整合素染色为阴性;而移植第3、5、7d后,存活皮片内CK19和β1整合素染色阳性的细胞重新出现,并且呈多层分布;流式细胞仪检测结果表明移植前后α6+CD71-和α6+CD71+细胞比例有明显差异。人细胞系HEKa体外培养6～7代时,开始出现老化迹象。细胞免疫组织化学检测结果显示此时细胞表达CK10为强阳性,而β1整合素、CK19表达为阴性,CK14则呈现弱阳性染色。在浓度为100ng/ml的bFGF诱导培养36～48h后,老化的HEKa细胞之间开始出现新生的表皮干细胞样克隆。这些细胞体积较小,为圆梭形,形态均一、折光性强、胞质近中央处有圆形核,核浆比大,因此称之为去分化来源的表皮干细胞（dHEK细胞）。dHEK细胞不但具有克隆形成能力,而且具有强大的分裂增殖能力。随着培养的延长,dHEK细胞克隆的面积逐渐增大,相互连接成片,并且和周围的HEKa细胞之间相互嵌合形成表皮嵴样结构。免疫组织化学检测发现bFGF诱导培养后,实验组细胞中β1整合素、CK19和CK14的表达增强;CK10作为终末分化细胞的标志,在bFGF诱导组中的表达明显降低。流式细胞检测分析显示bFGF作用后,实验组CK14表达阳性的细胞与对照组相比明显增多（分别为87.14%和67.26%）。CK19表达阳性的细胞也由原来的15.74%增加至被检测细胞总数的74.77%。而bFGF诱导作用后,被检测细胞中表达CK10阳性的细胞数量较对照组明显下降（分别为4.56%和98.56%）。此外,RT-PCR和Western-blot检测结果同样再次支持了表皮细胞去分化的现象。在bFGF作用后,表皮细胞重新程序化,并获得其前体干细胞的某些潜在能力,表达表皮干细胞的一些未分化蛋白。另外,表皮干细胞和去分化来源的dHEK细胞之间有两个显著的相同点:（1）二者都表达表皮干细胞的表面标志,如β1整合素、α6整合素和CK19等;（2）二者都存在着α6整合素和CD71表达的区域性分布差异。此外,表皮干细胞和dHEK细胞之间的差异点有:（1）CD71-PE和α6 integrin-FITC直标双色荧光流式检测分析显示表皮干细胞和去分化来源的dHEK细胞之间存在着细胞亚群的分布差异;（2）hTERT在表皮干细胞和去分化而来的干细胞中存在着亚细胞定位差异。结论:ESCs并非真正静止的未分化细胞,而是一种已经进入分化状态但是仍具有多向分化潜能的干细胞,其增殖分化行为不但受到自身程序化基因表达的影响,同时又受到其所处的微环境的调控。bFGF能够诱导表皮细胞在体外发生去分化,去分化而来的表皮干细胞与ESCs相比具有更加强大的分裂增殖能力,可以作为种子细胞应用于皮肤创伤修复与再生的相关研究之中。