特种经济植物天绿香和驱蚊香草遗传转化体系的建立及转昆虫抗冻蛋白基因的研究

论文摘要

温度是限制和决定植物地理分布的主要因子,也是影响植物生长发育和产量形成的重要限制因子。温度过高或过低所造成的热害或冷害,是一种危害农业生产的全球性自然灾害。植物受冷害现象尤为突出,几乎涉及所有的经济植物。一个世纪以来,植物冻害机理的研究受到世界各国学者的重视。在植物冻害的成因、植物在抗寒锻炼过程中的代谢途径、细胞结构（膜磷脂含量、膜脂脂肪酸不饱和度、细胞骨架的冷稳定性等）的变化,以及已经对农业生产产生良好的经济效益的水稻育秧抗寒剂的研制成功等诸方面都取得了很大进展。许多研究表明,植物要抵抗冰冻的危害,需要具备两个最基本的要素:一是避免细胞内结冰;二是细胞膜结构及核酸蛋白质等生命物质的低温稳定性。近年来,在植物温度逆境生理和逆境适应研究上取得了一定进展,并获得具有明显抗低温逆境的植物新品系（种）,尤其在植物抗寒育种领域,已取得较大突破。但这种常规的抗寒育种周期较长、植物的温度适应范围窄小,与生产应用尚存在一定差距。随着植物基因工程的蓬勃发展,人们将常规抗寒植物育种途径与基因工程相结合,开创了植物抗寒基因工程育种的新途径,并成功地获得具有很好抗寒性的多种植物新品种,成为解决植物寒害问题的重要途径之一。本实验通过农杆菌介导的方法将新疆荒漠昆虫准噶尔小胸鳖甲（Microdera punctipennis dzungarica）的抗冻蛋白基因Mpafp149导入热带植物天绿香和驱蚊香草,以期通过植物基因工程的手段改变植物的抗寒性。通过对抗性植株进行分子检测和生理生化检测,进一步证实新疆荒漠昆虫准噶尔小胸鳖甲（Microdera punctipennis dzungarica）的抗冻蛋白基因Mpafp149的抗冻活性,为抗冻蛋白的实际应用奠定了理论基础。首先,建立了农杆菌介导天绿香的遗传转化体系,并对影响农杆菌转化频率的各种因素进行了研究。结果表明:农杆菌介导天绿香遗传转化的潮霉素最佳筛选浓度为8 mg/L,预培养时间2d,共培养时间2d,菌液浓度OD600为0.2～0.25,浸染时间为8min适宜天绿香不定芽的诱导,有利于天绿香转基因植株的获得。通过PCR检测,初步证明外源基因Mpafp149已整合到天绿香基因组中。在此基础上,本研究还成功地建立了驱蚊香草的遗传转化体系,驱蚊香草遗传转化的潮霉素最佳筛选浓度为8 mg/L,预培养时间3d,共培养时间2d,菌液浓度OD600为0.2～0.25,浸染时间为8min适宜驱蚊香草不定芽的诱导,有利于驱蚊香草转基因植株的获得。通过PCR,RT-PCR检测,初步证明外源基因Mpafp149已整合到驱蚊香草基因组中。通过测定转基因驱蚊香草和野生型驱蚊香草的电导率、丙二醛含量,并将数据进行生物统计学分析表明转基因驱蚊香草植株获得了一定的抗寒性。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一部分 文献综述
• 第一章 抗冻蛋白研究进展
• 1 抗冻蛋白的特性
• 2 蛋白主要类型
• 3 抗冻蛋白的抗冻机制
• 4 抗冻蛋白的应用
• 5 展望
• 第二章 抗冻蛋白在植物基因工程中的应用
• 1 鱼类抗冻蛋白在植物基因工程中的应用
• 2 植物抗冻蛋白在植物基因工程中的应用
• 3 昆虫抗冻蛋白在植物基因工程中的应用
• 4 转基因工作中存在的问题
• 第三章 低温胁迫下植物抗冻性的研究
• 1 低温胁迫下植物的外渗电导率与电阻的变化
• 2 低温胁迫下植物体内叶绿素含量的变化
• 3 低温胁迫下植物抗氧化系统的生化响应
• 4 低温胁迫下植物体内脯氨酸、可溶性糖与植物的抗冻性渗透调节物质的变化
• 5 低温胁迫下植物体内丙二醛（MDA）含量的变化
• 6 结语
• 参考文献
• 第二部分 实验部分
• 第四章 天绿香遗传转化体系的建立
• 1 材料和方法
• 2 结果与分析
• 2.1 天绿香再生体系的建立
• 2.2 潮霉素（Hy）浓度对茎段不定芽再生的影响
• 2.3 预培时间和共培时间对转化率的影响
• 2.4 农杆菌菌液浓度及浸染时间对天绿香茎段转化的影响
• 2.5 目的基因的PCR 检测
• 3 讨论
• 第五章 驱蚊香草遗传转化体系的建立
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 2.1 驱蚊香草再生体系的建立
• 2.2 潮霉素（Hy）浓度对茎段不定芽再生的影响
• 2.3 侵染时间、预培时间和共培时间对转化率的影响
• 2.4 农杆菌菌液浓度对驱蚊香草茎段转化的影响
• 2.5 目的基因的PCR 检测
• 3 讨论
• 第六章 转昆虫抗冻蛋白基因驱蚊香草植株的分子检测及生理生化检测
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 酶及主要试剂、仪器
• 1.3 方法
• 1.3.1 转Mpafp149 基因驱蚊香草T0 代植株的RNA 提取
• 1.3.2 转Mpafp149 基因驱蚊香草T0 代植株总RNA 的DNaseⅠ消化
• 1.3.3 转Mpafp149 基因驱蚊香草的Southern-blot 检测
• 1.3.4 低温胁迫下植物相对电导率的测定
• 1.3.5 低温胁迫下植物MDA 含量的测定
• 2 结果
• 2.1 转基因驱蚊香草的RT-PCR 分析
• 2.2 转基因驱蚊香草的Southern-blot 检测分析
• 2.3 低温胁迫下转基因驱蚊香草和野生型驱蚊香草丙二醛含量的差异
• 2.4 低温胁迫下转基因驱蚊香草和野生型驱蚊香草相对电导率的差异
• 3 讨论
• 3.1 转基因驱蚊香草的分子检测
• 3.2 转基因驱蚊香草的生理生化检测
• 参考文献
• 小结与展望
• 致谢
• 个人简历