论文摘要
柑橘在世界农业经济中占有重要地位,但其产业发展一直受到柑橘溃疡病等病害的制约。栽培措施与农药对柑橘溃疡病防治能力有限,且化学农药还会造成严重的环境污染,抗病育种成为解决溃疡病危害的必然选择。柑橘常规育种受到珠心胚干扰、性器官败育、育种周期长、遗传上高度杂合等因素影响而进程缓慢,同时物种间的生殖隔离亦阻碍了常规育种进程。转基因技术的应用与抗病相关基因的克隆为柑橘抗溃疡病育种提供了新的思路。本研究以水稻白叶枯病广谱抗性基因Xa21为候选基因,以柑橘不同组织或器官为外植体材料,通过根癌农杆菌介导法进行了遗传转化;采用GUS组织化学染色、PCR和Southern blot等技术对转基因材料进行鉴定,并利用半定量RT-PCR和Real-time RT-PCR进行基因转录水平分析;最后通过细菌离体接种进行了抗病性分析,同时对Xa21基因在柑橘基因组中的表达进行了探讨。主要研究结果如下:1.柑橘离体再生体系的优化。1)不同培养基对愈伤组织再生体胚影响分析表明不同配方对体胚诱导能力不同,其中暗柳橙最佳体胚诱导配方为MT+2%甘油。同时发现适当逆境,如低温和营养缺乏有助体胚发生。对失去再生能力的愈伤组织,不同培养基配方似乎对体胚诱导不起作用。2)激素BA对暗柳橙根、子叶、根轴联结体、上胚轴、上胚轴薄细胞层等不定芽的诱导起决定作用,其浓度为4.0 mg/L时几乎所有外植体总芽数和壮芽数均达到最多。结果同时表明外植体再生能力的强弱同其相对伤害程度成反比,且暗培养有助于相对伤害程度大的外植体再生。3)改良温室微芽嫁接技术可有效提高外植体再生效率和缩短成苗时间。2.以体细胞胚、上胚轴茎段、根轴联结体、种子、子叶、根、上胚轴薄细胞层以及温室实生幼苗等为外植体的遗传转化,丰富了柑橘遗传转化外植体资源。其主要结果如下:以GFP为报告基因,建立了伏令夏橙体细胞胚遗传转化体系,获得转基因细胞系12个;GFP荧光和分子检测表明GFP基因已成功整合到柑橘基因组。基于该体系,将Xa21基因成功转入伏令夏橙和暗柳橙,获得转基因株系分别为6个和5个;GUS染色和分子检测表明基因已成功整合,拷贝数均为1个。该外植体降低了嵌合体发生率,且同外植体愈伤组织相比,减少了转化再生程序。以GFP为报告基因,建立了暗柳橙根轴联结体遗传转化体系,获得转基因株系34个;GFP荧光和分子检测表明GFP基因已经成功整合,拷贝数为1-4个。以该外植体进行转化可在较短时间（80 d）内获得转基因植株,与外植体上胚轴相比再生效率和转化效率均得到提高,但转化中对报告基因GFP的依赖性将限制其应用。同时转化过程中GFP荧光检测发现,转化事件多发生在形成层部位。嵌合体产生于多个细胞（包括转化与非转化细胞）的“整合”,其产生初期,多个细胞间“嵌合线”明显,后逐渐模糊至消失。3.柑橘愈伤组织抗潮霉素筛选再生体系的建立与再生株系溃疡病抗性分析。基于潮霉素再生体系,共获得13种基因型转化愈伤组织,其中8种基因型获得再生体细胞胚,2种基因型获得再生植株。获得再生植株基因型为暗柳橙和伏令夏橙,其转基因株系分别为95个和32个,PCR阳性率分别达到90.2%和85.6%。结果同时还表明遗传转化效率同愈伤组织增殖和分化的加性效应成正比。转基因植株的组织化学、整合、转录和抗病水平检测。GUS染色表明嵌合现象较少发生,其中转基因暗柳橙纯合率达到98.0%,推测愈伤组织转化再生多为单细胞起源。PCR和Southern blot分析表明Xa21基因多以1-2个拷贝插入到柑橘基因组,插入后T-DNA区三个基因未发生分离与重排。Real-time RT-PCR分析表明外源基因在多数转基因株系表达,但表达量高低不等,多数表达水平较低。离体叶片病原菌接种显示暗柳橙约36.7%的转基因株系抗性得到提高,该结果表示Xa21基因可用于柑橘抗溃疡病育种。对上述结果综合分析表明转基因植株抗性大小与R基因（Xa21）位置效应与遗传背景相关性较大,而与拷贝数、转录水平相关性较小。针对温室转基因植株叶片发育中不能完全伸展的问题,对株高、叶形指数和倍性进行了分析,结果表明转基因与非转基因植株无显著差异性,推测为外源基因插入导致。对柑橘LRR基因家族密码子使用偏好性进行分析,结果显示该家族高频密码子共有14个,其密码子使用情况同水稻NBS-LRR家族不同,同柑橘和水稻基因组本身亦不相同。上述原因可能影响外源基因表达与植株形态。本文还对遗传转化外植体的选择,如何提高柑橘遗传转化效率,遗传转化的发生与形成,基因家族密码子偏爱性,抗病基因在柑橘育种中的应用潜力等进行了探讨。
论文目录
相关论文文献
标签：柑橘论文; 基因论文; 遗传转化外植体论文; 抗病育种论文; 根癌农杆菌论文; 柑橘溃疡病论文; 潮霉素论文; 密码子使用论文;