论文摘要
目的:探索多发性硬化的分子机制并寻找该疾病脑脊液、血清的蛋白质标志物以及了解该蛋白质在EAE动物模型脊髓中的异常表达,探讨其在MS的发病机制以及修复机制中的作用,为药物疗效观察提供实验资料。方法:1.紧张型头痛患者脑脊液样本经超滤浓缩并除盐、以ProteoExtractAlbumin/IgG Removal Kit试剂盒去除高丰度蛋白,Bradford法测定蛋白质浓度,双向凝胶电泳,硝酸银染色以及考马斯亮蓝染色,应用ImageMaster2DPlatinum5.0软件分析凝胶图谱图像,寻找差异性蛋白点,与SWISS-2DPAGE数据库进行比对,将感兴趣的蛋白点切下,经胶内酶切,以肽质量指纹质谱技术鉴定,利用MASCOT软件和NCBInr数据库进行检索并鉴定蛋白质。2.按建立的脑脊液蛋白质组学研究技术体系,多发性硬化患者与紧张型头痛患者各6例的脑脊液进行比较蛋白质组学研究。鉴定和分析差异性蛋白质点。3.健康受试者血清样本经除盐、去除高丰度蛋白,Bradford法测定蛋白质浓度,双向凝胶电泳,硝酸银染色以及考马斯亮蓝染色,应用ImageMaster2DPlatinum5.0软件分析凝胶图谱图像,寻找差异性蛋白点,与SWISS-2DPAGE数据库进行比对,将感兴趣的蛋白点切下,经胶内酶切,以肽质量指纹质谱技术鉴定,利用MASCOT软件和NCBInr数据库进行检索蛋白质。4.按建立的血清蛋白质组学研究技术体系,多发性硬化患者与健康受试者各8例的血清进行比较蛋白质组学研究。鉴定和分析差异性蛋白质点。5.应用豚鼠全脊髓匀浆（GPSCH）加福氏完全佐剂皮下注射免疫Wistar大鼠,观察其临床症状以及病理学改变,建立EAE的Wistar大鼠动物模型。6.EAE动物模型的各段脊髓经取材,包埋,切片,以二步法免疫组织化学染色,观察APOE在各段脊髓灰白质内的表达;以SP法免疫组织化学染色,观察胶质纤维酸性蛋白（GFAP）在各段脊髓灰白质内的表达。结果:1.硝酸银染色:可检测到316个蛋白质点;考马斯亮蓝染色:可检测到201个蛋白质点;蛋白电泳凝胶的重复性研究,两次银染的匹配率为93.2%,通过对任选的30个匹配蛋白质点的pI值和MW值比较,结果无统计学差异,技术体系的重复性良好。2.38种蛋白质的表达在多发性硬化患者与对照组显著差异,部分差异性蛋白质经鉴定为白蛋白单体CRAn、ATP合成酶、普通转录因子IIH、白蛋白单体CRAj、四连接素、结合珠蛋白、丛生蛋白、富亮氨酸α-2糖蛋白、视黄醇结合蛋白、甲状腺结合蛋白。3.硝酸银染色:可检测到233个蛋白质点;考马斯亮蓝染色:可检测到168个蛋白质点;蛋白电泳凝胶的重复性研究,两次银染的匹配率为94.6%,通过对任选的30个匹配蛋白质点的pI值和MW值比较,结果无统计学差异,技术体系的重复性良好。4.23种蛋白质的表达量在多发性硬化患者与对照组显著差异,部分差异性蛋白质经鉴定为载脂蛋白E、丝氨酸蛋白酶抑制因子A1、白蛋白A链、a-1酸性糖蛋白1、α-1微糖蛋白、丛生蛋白、结合珠蛋白、富亮氨酸α-2糖蛋白、视黄醇结合蛋白、甲状腺结合蛋白。5.EAE组发病率100%,发病时间为免疫后（14.1±2.6）天,呈慢性单相病程;HE染色见EAE组大脑、小脑、脑干以及脊髓组织大量炎性细胞浸润,血管周围形成炎细胞袖套,脊髓的病理改变严重,其中以白质与灰白质交界区域为著;Luxol fast blue染色见EAE组脊髓白质脱髓鞘改变。对照组无上述病理改变。6.EAE组炎性细胞聚集在血管周围形成袖套样改变,其血管周边APOE免疫反应阳性明显;对照组无上述病理改变。白质区域中的APOE免疫反应阳性细胞明显多于对照组。灰质区域中的APOE免疫反应强于对照组。阴性对照均未见DAB染色。GFAP染色提示白质中APOE染色阳性细胞大部分来源于星形细胞。结论:多发性硬化患者脑脊液、血清中多种蛋白质表达差异,可能存在能量代谢异常、炎症反应和组织修复机制;其中APOE在EAE中表达异常,反映星形细胞参与MS的修复机制。
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