一年生野生稻线粒体基因组及其在远缘杂交中的重组

论文摘要

水稻是我国最主要的粮食作物之一,而杂交稻对于促进粮食增产具有举足轻重的作用。其中三系杂交稻仍然是杂交稻的主体,其利用基础则是细胞质雄性不育。线粒体中细胞质雄性不育基因受核恢复基因调控,研究细胞质雄性不育是了解植物核质互作与信息交流的一个窗口,对于认识植物核质互作]促进三系杂交水稻的进一步发展意义重大。本研究测序分析了一个一年生野生稻线粒体基因组,研究其回交选育细胞质雄性不育系过程中线粒体基因组的重组与结构变化,比较分析了水稻线粒体基因组间的特异序列及其在细胞质雄性不育线粒体基因组中的分布特征与潜在功能。主要研究结果如下：1、为了了解配子体细胞质雄性不育线粒体基因组特点,采用Solexa测序方法测序分析一年生野生稻（W20）线粒体基因组。结果显示,基因组序列全长为542,103bp,与多年生野生稻基因大小接近；基因组包含312,096bp的类核序列,占线粒体基因组的57.6%,其中约250kb（44.6%）与12号染色体20597115-20845508bp区段同源。比较分析6个已测水稻线粒体基因组保守序列,发现CMS线粒体基因组保守序列的排列模式共线性较差,因此,CMS可能是线粒体基因组广泛重组的产物,具有加快线粒体基因组结构进化的功能。此外,在W20线粒体基因组中发现一个与orf288部分同源的嵌合基因,当引入恢复基因时,其表达量下调；同时,还鉴定到一个178bp反向重复序列介导的线粒体重组,使基因组处于一个多分子状态。2、比较分析W20和其他5个已测序的线粒体基因组序列,发现存在大量的线粒体特异序列（Mitochondrial specific-sequences,MSS）,其中W20中MSS约占基因组大小的7.0%。根据25对MSS多态性引物对38个AA基因组水稻品种进行聚类,结果表明,MSS基本上能将不同水稻品种聚类鉴别,且对非AA基因组水稻的聚类区分效果更明显。因此,MSS特异标记可用于进化分析。部分MSS区域含有功能未知的ORF,其大部分ORF可以转录。比较分析孢子体不育系（WA）和配子体不育系（LD和CW）线粒体基因组序列,发现了一些孢子体和配子体特异的MSS。利用其扫描验证我国具有代表性的孢子体不育系和配子体不育系及相应的保持系。结果表明,共有16个不育特异的MSS,其中3个为不育细胞质所特有、9个为孢子体特异、4个配子体特异。Southern杂交结果表明不育特异MSS在线粒体基因组上的位置是稳定的。这些MSS引物可作为分子标记鉴定不育系,可区分孢子体不育系和配子体不育系,在这些不育MSS中检测到11个可表达、不育特异的ORFs。3、为了研究远源杂交过程中的线粒体基因组重组,构建了一年生野生稻W20与栽培稻粤泰B（YB）杂交回交群体,并同源克隆了osRECAl、osRECA4、osRECA7、 osMutsl和osOSBl五个可能与水稻线粒体基因组重组相关基因,cDNA测序结果表明,只有osRECA4、osRECA7在W20和YB之间存在差异,这两个等位变异在BC2代以后其基因型与YB的完全一致,W20与YB杂交回交子代在4个重复序列介导的线粒体重组中出现重组模式差异,其中两个为正向重复序列（DR）RepeatA（144bp）和RepeatB（117bp）,两个为反向重复序列（IR） RepeatC（121bp）和RepeatD（82bp）;比较分析W20与W20/YB F,突变单株的不育相关基因orf79及orf79与基因组其他位置重组产生Sublimon拷贝数,结果表明,在突变株中,重复序列介导orf79基因重组导致orf79基因拷贝数急剧下降,发生SSS现象,而相应的主环分子及主环分子重组产生的Sublimon的拷贝数明显增加,而orf79介导重组的Sublimon消失。4、比较分析了嵌合基因orf288及其重组变异体orf290, or/310和orf352的结构、线粒体基因组中的位置及其在水稻中的分布,4个基因编码的氨基酸序列C端序列基本一致,差异主要集中在N端。在线粒体基因组中4个嵌合基因的位置互不相同。对15个水稻不育系及保持系的分析表明,orf288只在红莲型保持系YB中存在；而配子体细胞质不育系YA、W15A和W46A含有orf290; W20A、W34ABA、CJ23A和HX41A含orf310,所有7个孢子体不育系都含有orf352;转基因功能验证表明,嵌合基因orf1D和orf290可能与水稻育性相关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 缩写词
• 第一章 文献综述
• 1.1 植物线粒体基因组
• 1.1.1 植物线粒体基因组大小、结构变异
• 1.1.2 植物线粒体基因组分子结构模型
• 1.1.3 植物线粒体基因组的基因
• 1.1.4 水稻线粒体基因组
• 1.2 植物线粒体基因组基因的进化
• 1.2.1 核糖体RNA基因的进化
• 1.2.2 转移RNA基因的进化
• 1.2.3 植物线粒体蛋白质基因进化
• 1.2.4 线粒体基因的转移
• 1.3 高等植物线粒体基因组的异质性
• 1.3.1 重复序列介导的重组导致的异质性
• 1.3.2 小规模的线粒体基因组突变
• 1.3.3 父系渗漏
• 1.3.4 异质性的遗传和体细胞分离
• 1.3.5 异质性的鉴定
• 1.4 重复序列与线粒体基因组重组
• 1.4.1 线粒体基因组重复序列
• 1.4.2 重复序列介导的线粒体基因组重组机制
• 1.4.3 线粒体基因组重组对于植物线粒体稳定性的作用
• 1.5 植物线粒体基因组重组相关基因的克隆及功能研究
• 1.6 植物线粒体基因组与细胞质雄性不育关系
• 1.6.1 CMS现象
• 1.6.2 线粒体基因与CMS
• 1.6.3 CMS涉及的核质互作-不育与恢复
• 1.6.4 水稻线粒体基因组雄性不育与育性恢复
• 1.7 植物线粒体与核及质体之间的交流信号
• 1.8 高通量测序技术的发展
• 1.8.1 第一代DNA测序技术
• 1.8.2 第二代DNA测序技术
• 1.8.3 第三代测序技术
• 1.9 本研究目的与意义
• 第二章 一年生野生稻线粒体基因组
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 水稻材料
• 2.1.2 水稻超纯线粒体及线粒体基因组DNA提取
• 2.1.3 基因组总DNA提取
• 2.1.4 Southern杂交
• 2.1.5 Trizol法提取RNA
• 2.1.6 Northern杂交
• 2.1.7 Solexa测序
• 2.1.8 线粒体基因组组装及注释
• 2.1.9 Nuclear-like和Chlo-like序列
• 2.1.10 保守序列
• 2.1.11 线粒体基因组重复序列分析
• 2.1.12 共线性分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 一年生野生稻W20线粒体基因组DNA提取及鉴定
• 2.2.2 W20线粒体基因组测序与注释
• 2.2.3 水稻线粒体基因组类核和类叶绿体序列
• 2.2.4 水稻线粒体基因组保守序列比较分析
• 2.2.5 W20线粒体基因组嵌合基因的鉴定及表达分析
• 2.2.6 水稻线粒体基因组重复序列
• 2.2.7 重复序列介导的W20线粒体基因组重组
• 2.3 讨论
• 2.3.1 水稻线粒体基因组大小和结构的分化
• 2.3.2 植物线粒体基因组的类核和类叶绿体序列
• 2.3.3 植物线粒体基因组短重复序列与杂合态及鉴定
• 附表
• 第三章 水稻线粒体基因组特异序列与进化
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 水稻材料
• 3.1.2 水稻基因组总DNA提取
• 3.1.3 线粒体基因组RNA提取和cDNA反转录合成
• 3.1.4 线粒体基因组特异序列分析
• 3.1.5 PCR产物克隆测序
• 3.1.6 系统进化树的构建
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 水稻线粒体基因组中的特异序列分析
• 3.2.2 水稻线粒体基因组特异序列中ORFs及表达
• 3.2.3 水稻线粒体基因组特异序列与AA基因组线粒体组型
• 3.2.4 水稻线粒体基因组特异序列与线粒体基因组进化
• 3.3 讨论
• 3.3.1 水稻线粒体基因组特异序列分化及应用
• 3.3.2 水稻线粒体基因组特异序列的表达
• 第四章 水稻细胞质雄性不育线粒体基因组特异序列鉴定
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 水稻材料
• 4.1.2 水稻总DNA提取
• 4.1.3 水稻总RNA提取及cDNA转录
• 4.1.4 Southern杂交
• 4.1.6 不育特异序列搜索
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 比较基因组学分析水稻不育线粒体基因组特异序列
• 4.2.2 基于MSS开发细胞质雄性不育特异分子标记
• 4.2.3 不育细胞质特异MSS在线粒体基因组位点保守性
• 4.2.4 不育特异细胞质特异MSS中ORFs鉴定
• 4.3 讨论
• 第五章 一年生野生稻与栽培稻杂交过程中线粒体基因组重组
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 水稻材料
• 5.1.2 水稻总DNA提取
• 5.1.3 同源基因克隆测序
• 5.1.4 重组半定量PCR分析
• 5.1.5 重组qPCR分析
• 5.1.6 亚细胞定位预测
• 5.1.7 序列比对分析
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 野生稻与栽培稻杂交回交群体构建
• 5.2.2 野生稻与栽培稻中控制线粒体基因组重组相关基因序列分析
• 5.2.3 远源杂交过程中短重复序列介导的线粒体基因组重组
• 5.2.4 杂交过程中不育相关基因orf79的重组
• 5.3 讨论
• 5.3.1 杂交与线粒体基因组杂合态
• 5.3.2 不育相关基因orf79的稳定性
• 附表
• 第六章 线粒体嵌合基因orf288的进化和功能初步研究
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 水稻材料
• 6.1.2 克隆测序
• 6.1.3 半定量RT-PCR
• 6.1.4 orf288及重组型特异序列亚化学计量迁移分析
• 6.1.5 转基因载体构建
• 6.1.6 农杆菌介导籼稻转化
• 6.1.7 转基因植株花粉育性鉴定
• 6.1.8 序列比对分析
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 水稻线粒体基因组orf288及嵌合基因的结构
• 6.2.2 orf288及其嵌合基因型特异序列亚化学计量迁移
• 6.2.3 orf290和orf310对水稻育性的影响
• 6.3 讨论
• 6.3.1 线粒体基因组嵌合基因的进化
• 6.3.2 水稻配子体细胞质不育相关ORFs
• 参考文献
• 博士在读期间发表和待发表的论文及申请专利
• 致谢