喜温硫杆菌蛋白质组学研究技术建立及抗砷机制初步探讨

论文摘要

喜温硫杆菌（Acidthiobacillus caldus）是一类专性自养极端嗜酸性硫杆菌,分布于硫化矿床、酸性矿水及土壤中。喜温硫杆菌在生物浸矿、煤的脱硫、含硫废水的处理等方面及在自然界的硫循环中都占有重要地位,尤其在生物冶金中有广泛应用,是浸矿复合菌系中的主要组分之一。它可以利用附着在矿物表面的固体硫,暴露出矿物表面,从而使浸矿细菌充分接触到矿物并起作用;其代谢产物还可被其它浸矿细菌所利用,并有助于硫的溶解。通过这些机理,喜温硫杆菌大大提高了浸矿效率,在生物冶金中发挥着重要的作用。在生物冶金的应用过程中,喜温硫杆菌对存在于矿石中的重金属如砷、汞、银等缺乏抗性或抗性不强,使得菌体活性降低,浸矿效率下降。已有研究证明,喜温硫杆菌通过系列驯化可以提高对重金属（如砷）的抗性,但是这种抗性随着砷胁迫压力的消失会很快丧失。这表明喜温硫杆菌胞内存在着对重金属胁迫的适应机制。利用蛋白质组学技术对其进行研究,对阐明该菌耐重金属机制以及构建高效抗重金属工程菌并用于生产应用具有重要意义。目前蛋白质组学研究主要有组成性蛋白质组学研究和差异比较蛋白质组学研究两种策略。本研究采用差异比较蛋白质组学研究策略,以喜温硫杆菌的砷抗性为研究突破口,比较了喜温硫杆菌野生株（耐受10mM亚砷酸钠）和驯化株（耐受30mM亚砷酸钠）的蛋白表达差异,对差异蛋白进行质谱鉴定,试图揭示喜温硫杆菌的耐砷机制。喜温硫杆菌蛋白质组学研究方面,国内外还未见报道。蛋白质二维电泳技术结合质谱鉴定是进行蛋白质组学研究的主要手段。其中二维电泳技术又因材料的不同而使技术流程和分离效果呈现较大的差别,因此建立喜温硫杆菌蛋白质二维电泳技术方法是进行该菌蛋白质组学研究的基础。本实验建立了喜温硫杆菌胞内全蛋白二维电泳技术,并获得了高重现性的喜温硫杆菌蛋白图谱。在pH4-7的驯化菌株蛋白电泳图谱中解析出了1188个蛋白点,共有335个蛋白的表达发生了差异。与野生株相比,驯化菌株中,新产生60个蛋白点,49个蛋白点消失。利用基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱及其串联质谱分析,有6个点得到了鉴定,包括D11、D14,D9、D13、D18、D19。根据数据库比对及聚类分析,我们推测该几类蛋白分别属于蛋白合成因子、尿嘧啶DNA糖基酶、鞭毛收缩ATP酶Pi1T、氨基转移酶,并可能在喜温硫杆菌抗砷过程中发挥着重要作用。除了这6个蛋白外,我们还对另外14个蛋白点进行了鉴定,由于这些蛋白点可能是新蛋白或者与现有数据库中的已知蛋白的序列相似性太低,这些蛋白的性质以及它们在耐砷过程中所起的作用有待于进一步的研究。综上所述,本研究首先建立了喜温硫杆菌蛋白质组的研究技术方法,研究了野生型菌株与抗砷菌株的蛋白质表达差异,并对差异蛋白进行了质谱鉴定和数据库检索分析。通过分析,我们推测了喜温硫杆菌中参与抗砷的功能蛋白和可能的调控机制,为进一步研究喜温硫杆菌的抗砷性能奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 符号说明
• 第一章 前言
• 1.1 蛋白质组学的产生及其研究内容
• 1.2 蛋白质组学研究技术
• 1.2.1 蛋白质分离技术
• 1.2.2 蛋白质鉴定技术
• 1.3 自养细菌蛋白质组学研究进展
• 1.4 喜温硫杆菌菌种特性及其在生物冶金中的应用
• 1.4.1 喜温硫杆菌菌种特性
• 1.4.2 喜温硫杆菌在生物冶金中的应用
• 1.5 微生物抗砷机制研究
• 1.5.1 arsB体系
• 1.5.2 ArsM甲基化体系
• 1.5.3 ACR体系
• 1.5.4 Ycflp体系
• 1.5.5 Aox氧化体系
• 1.6 本研究的目的和意义
• 第二章 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验所用菌株
• 2.1.2 实验所用培养基及缓冲液
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 培养基和培养条件
• 2.2.2 抗砷菌株驯化
• 2.2.3 菌体培养
• 2.2.4 菌体收集
• 2.2.5 细胞裂解
• 2.2.6 蛋白质TCA/丙酮沉淀:
• 2.2.7 蛋白溶解液浓度定量
• 2.2.8 第一向等电聚焦
• 2.2.9 胶条的平衡
• 2.2.10 第二向SDS-PAGE电泳
• 2.2.11 蛋白胶染色:
• 2.2.12 图像获得及PDQuest软件分析
• 2.2.13 差异蛋白点胶内酶解
• 2.2.14 质谱鉴定蛋白
• 2.2.15 蛋白数据库搜索匹配
• 第三章 结果与分析
• 3.1 蛋白浓度定量方法确立
• 3.1.1 紫外线（UV）吸收法
• 3.1.2 Bradford法测定蛋白质含量
• 3.1.3 双缩脲法测定蛋白质含量
• 3.1.4 BCA法测定蛋白质组学样品浓度
• 3.1.5 小结
• 3.2 喜温硫杆菌胞内全蛋白双向电泳技术建立和稳定图谱的构建
• 3.2.1 同一pH范围线性与非线性胶条喜温确杆菌蛋白电泳图谱比较
• 3.2.2 不同窄pH范围IPG胶条对喜温硫杆菌全蛋白质的分离
• 3.2.3 不同SDS-PAGE胶浓度对喜温硫杆菌胞内全蛋白的分离
• 3.2.4 用生物信息学软件对蛋白电泳图谱的处理效果展示
• 3.2.5 小结
• 3.3 喜温硫杆菌抗砷菌株驯化
• 3.4 喜温硫杆菌砷胁迫蛋白差异表达图谱建立及分析
• 3.4.1 pH4-7范围下喜温硫杆菌全蛋白差异表达图谱
• 3.4.2 pH5-8范围下喜温硫杆菌全蛋白差异表达图谱
• 3.4.3 pH3-10NL范围下喜温硫杆菌全蛋白差异表达图谱
• 3.4.4 用PDQuest软件对差异表达蛋白图谱进行分析
• 3.5 质谱鉴定差异蛋白及聚类分析
• 3.5.1 与蛋白表达有关的差异蛋白分析
• 3.5.2 未聚类抗砷相关蛋白分析
• 3.5.3 其它可能相关蛋白
• 第四章 讨论与展望
• 4.1 喜温硫杆菌蛋白质组学研究技术的建立
• 4.2 蛋白质的准确上样是差异比较蛋白质组学研究成功与否的关键一环
• 4.3 喜温硫杆菌抗砷机制是一个复杂的可能涉及到多种因素的过程
• 4.4 本研究工作的创新与不足
• 4.5 对本课题进一步研究的几点想法
• 4.6 总结
• 参考文献
• 致谢
• 学位论文评阅及答辩情况表