论文摘要
H9N2亚型禽流感严重危害我国养禽业的发展,我国研发以不同毒株制备的H9亚型流感疫苗,但现有疫苗对新出现毒株间交叉保护力弱,给我国H9N2禽流感疫情防控带来困难。目前研究报道的针对M2e的广谱性多肽疫苗,为禽流感的防控提供新的思路。而免疫增强剂是提高疫苗免疫效力有效途径之一。我们在现有研究基础上,筛选出一种新型免疫增强剂CVC2305。本研究综合评价免疫增强剂CVC2305对H9亚型禽流感疫苗和M2e多肽疫苗免疫效力。1.免疫增强剂对H9N2亚型禽流感灭活苗免疫效力的影响本研究评价免疫增强剂对H9亚型灭活疫苗在鸡体免疫效力的影响。以添加CVC2305免疫增强剂H9亚型禽流感疫苗和常规H9亚型禽流感疫苗分别免疫SPF鸡,并设空白对照组。以上疫苗用毒株为A/Chicken/NJ/02/2001.免疫鸡经流式细胞仪检测免疫后1、3、5和7 d的CD3+/CD4+和CD39+/CD8+T淋巴细胞亚群的分类比例及其规律。用共聚焦显微镜经间接免疫试验检测不同免疫组淋巴细胞递呈抗原的状态。另在免疫后3 d用A/Chicke/SD/01/2011（SD01/11）攻毒,比较攻毒保护效果。另用B19/B19近交系SPF鸡免疫上述两种疫苗,另设对照组。在免疫后第10 d,剖杀无菌取脾脏,分离淋巴细胞,转移至未经任何处理的受体鸡,转移后24 h,立即对受体鸡进行攻毒（SD01/11）,比较攻毒保护效果。流式检测结果显示,在免疫后的第1、3、5和7d,含免疫增强剂疫苗组的CD3+/CD4+和CD3+/CD8+T淋巴细胞亚群的分类比例均高于常规疫苗免疫组,并呈时间推移略有增强。而同批鸡的抗体效价在后续的第2、3和4周检测,亦显示含免疫增强剂组高于常规疫苗组。共聚焦显微镜进行淋巴细胞的间接免疫荧光检测显示,含免疫增强剂疫苗组的淋巴细胞交叉递呈现象显著高于常规疫苗组。免疫后3 d进行异源毒株攻毒,结果显示,含免疫增强剂组的保护效果优于常规疫苗免疫组。近交系SPF鸡进行淋巴细胞转移试验后,对受体鸡进行异源毒株攻毒,结果显示含免疫增强剂组的保护效果优于常规疫苗免疫组。综合上述结果表明,CVC2305免疫增强剂添加至H9亚型禽流感苗中,能显著提高疫苗的免疫保护效力,包括体液免疫和细胞免疫效力。2.免疫增强剂对M2e（H9）禽流感多肤苗免疫效力的影响根据H9亚型禽流感病毒M2e蛋白的保守氨基酸序列,合成多肽制备成M2e多肽苗,作为一个免疫组。另将CVC2305免疫增强剂添加到该多肽苗中,制备M2e-CVC2305苗,作为一个免疫组。设常规H9疫苗组,空白对照组。2 w龄商品鸡用上述多肽疫苗每隔2周进行加强免疫,共免3次。H9商品苗仅在2w龄免疫一次。第一次免疫后每隔2 w采血,直至第8 w。血清用ELISA检测针对M2e抗体和病毒血清中和试验检测针对同源毒株（NJ02）的中和抗体,]EACS检测NJ02感染MDCK细胞的间接免疫荧光和单纯间接免疫荧光检测,以及在一免后8w进行异源毒株（SD01）攻毒。结果表明,针对M2e的ELISA抗体效价从高到低依次为M2e-CVC2305免疫组、常规M2e组、H9疫苗组和对照组。血清中和试验表明,H9疫苗组中和效价高于M2e-CVC2305免疫组,后者高于常规M2e组。FACS检测间接免疫荧光和单纯的MDCK细胞间接免疫荧光检测,以及异源毒株攻毒结果均表明,荧光强度依次为H9疫苗组M2e-CVC2305免疫组、M2e组和对照组。攻毒试验结果显示,各组的保护效力同荧光强度分布,效力从高至低为H9疫苗组、M2e-CVC2305免疫组、M2e组和对照组。上述结果表明免疫增强剂CVC2305能有效提高M2e多肽的免疫效力,该免疫增强剂在多肽疫苗的应用中显示良好的前景。