超顺磁微球的制备及其在螨虫过敏原和转基因检测的初步应用

论文摘要

超顺磁微球是将利用纳米技术制备出来的一种具备超顺磁特性的纳米粒子再包覆于高分子材料中的高分子微球。超顺磁微球具有超顺磁性和表面覆盖活性基团等特点,在生物技术和生命科学等领域具有广泛的应用价值。本论文制备了具有表面羧基活性的能满足生物磁分离要求的超顺磁微球。并利用绿色荧光蛋白（GFP）初步验证了超顺磁微球的性能。应用自制超顺磁微球在螨虫过敏原特异性抗体IgE和转基因片段的检测两方面进行了初步的应用。主要研究结果如下：1.制备了50nm、200nm和1μm三种粒径的超顺磁微球。通过扫描电镜和红外光谱分析等一系列的方法进行了功能表征分析。结果显示,三种粒径的超顺磁微球的形貌都为规则的球形,粒径均一,单分散性良好,表面均为羧基官能团修饰,磁响应性良好,满足生物磁分离的技术要求。2.将制备好的超顺磁微球与GFP抗体交联后,捕获粗提液中的GFP蛋白,利用GFP蛋白的荧光特性进行芯片扫描分析。结果表明：自制的超顺磁微球能与GFP抗体偶联；偶联后的免疫超顺磁微球能特异性结合GFP,且随着粗提液中GFP浓度的升高,超顺磁微球富集GFP蛋白后的荧光检测值也逐渐升高；利用该免疫超顺磁微球富集的方法,可以特异性分离纯化到靶标分子GFP蛋白。3.研究了三种粒径的超顺磁微球与抗人IgE的抗体偶联,制成免疫超顺磁微球。比较了这三种免疫超顺磁微球对血清中总IgE的检测效果,发现三种检测效果均优于常规检测,其中又以200nm与1μm免疫超顺磁微球的检测效果最好,并分析获得了检测血清IgE的最适免疫超顺磁微球用量。在上述基础上,发明了一种基于超顺磁微球与抗人IgE的抗体偶联检测过敏原的方法。该方法提高了检测的灵敏度,尤其是在sIgE浓度较低时。分析还表明,在IgE总量一定的情况下,待测样品的体积扩大至常规检测方法的3倍时,检测灵敏度不受影响；随着体积的进一步扩大,检测值有所下降,扩大为10倍时,趋近于常规方法的检测值。4.发明了一种采用免疫超顺磁微球检测过敏原特异性IgE抗体（sIgE）的方法,该方法以超顺磁微球为载体,直接偶联户尘螨过敏原蛋白,进而检测户尘螨过敏原特异性IgE抗体。应用该方法在sIgE浓度为0.035 IU/mL-3.5 IU/mL的范围内建立了线性关系,R2=0.9874,相关系数良好。5.以转基因中常用的玉米Ubi-1启动子序列作为检测靶基因。通过偶联氨基修饰的部分或全长Ubi-1启动子制成磁珠探针,捕获靶基因片段。利用芯片扫描技术对磁珠探针的富集效果检测,结果显示荧光检测值与拷贝数量成正比关系,且磁珠探针偶联的核酸片段越长,检测效果越好。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第一章 文献综述
• 1 超顺磁微球
• 1.1 超顺磁微球的介绍
• 1.2 超顺磁微球的制备方法
• 2 螨虫过敏原及其免疫学检测
• 2.1 螨虫的介绍及对人类的危害
• 2.2 过敏性疾病及其检测方法
• 3 转基因生物中靶基因检测研究概况
• 4 超顺磁微球在生物学检测的应用
• 4.1 针对不同的应用对象
• 4.1.1 细胞
• 4.1.2 蛋白质和多肽
• 4.1.3 核酸
• 4.1.4 酶
• 4.2 针对不同的应用方法
• 4.2.1 分离纯化
• 4.2.2 检测磁性能
• 4.3 对过敏原的检测应用
• 4.4 对转基因生物中靶基因的检测应用
• 5 本研究的目的意义和主要研究内容
• 第二章 超顺磁微球的制备及表征
• 1. 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 所需试剂
• 1.1.2 仪器与设备
• 3O₄磁流体的制备'>1.2 纳米Fe₃O₄磁流体的制备
• 1.3 不同粒径羧基修饰超顺磁微球的制备
• 1.3.1 水热法制备羧基修饰的50nm超顺磁微球
• 1.3.2 水热法制备羧基修饰的200nm超顺磁微球
• 1.3.3 分散聚合法制备羧基修饰的1μm超顺磁微球
• 1.4 分散聚合法制备1μm超顺磁微球的影响因素
• 1.4.1 丙烯酸对微球形态及表面羧基含量的影响
• 1.4.2 分散剂PEG对微球形态的影响
• 1.4.3 引发剂对微球形态的影响
• 1.4.4 分散介质极性对微球形态的影响
• 1.5 不同粒径羧基修饰超顺磁微球的表征分析
• 1.5.1 超顺磁微球的形态分析
• 1.5.2 红外光谱分析
• 1.5.3 化学滴定法测定微球表面羧基含量
• 1.5.4 超顺磁微球的磁性能分析
• 2. 结果与分析
• 2.1　1μm超顺磁微球合成的影响因素
• 2.1.1 丙烯酸用量对微球形态及表面羧基含量的影响
• 2.1.2 分散剂PEG对微球形态的影响
• 2.1.3 引发剂对微球形态的影响
• 2.1.4 分散介质极性对微球形态的影响
• 2.2 超顺磁微球的形态分析
• 2.3 红外光谱分析
• 2.4 化学滴定法测定羧基含量
• 2.5 超顺磁微球的磁性能分析
• 3. 小结与讨论
• 第三章 超顺磁微球偶联特性和检测效果分析
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株和超顺磁微球
• 1.1.2 所需试剂与仪器
• 1.2 GFP蛋白粗提液的制备
• 1.3 超顺磁微球和GFP抗体的偶联率分析
• 1.4 免疫超顺磁微球检测效率分析
• 1.5 免疫超顺磁微球与GFP蛋白孵育时间的分析
• 1.6 基于免疫超顺磁微球GFP蛋白分离纯化
• 2. 结果与分析
• 2.1 GFP蛋白粗提液的定量
• 2.2 免疫超顺磁微球检测效率分析
• 2.3 免疫超顺磁微球与GFP蛋白孵育时间的分析
• 2.4 基于免疫超顺磁微球的GFP蛋白分离纯化
• 3. 小结与讨论
• 第四章 螨虫过敏原特异性抗体IgE的检测
• 1. 材料与方法
• 1.1 所需试剂与仪器
• 1.2 抗人IgE抗体的免疫超顺磁微球制备
• 1.3 不同粒径的免疫超顺磁微球对IgE检测效果的比较
• 1.4 检测血清IgE的最适免疫超顺磁微球用量分析
• 1.4.1 200nm免疫超顺磁微球的最适用量分析
• 1.4.2 1μm免疫超顺磁微球的最适用量分析
• 1.5 螨虫特异性抗体的免疫超顺磁微球检测
• 1.6 酶联免疫法检测OD值
• 1.7 IgE浓度对免疫超顺磁微球检测的影响
• 1.8 免疫超顺磁微球检测获得的OD值与总IgE浓度的关系
• 1.9 户尘螨过敏原免疫超顺磁微球制备及对户尘螨过敏原特异性抗体（sIgE）检测试验
• 2. 结果与分析
• 2.1 200nm超顺磁微球与抗体的偶联率分析
• 2.2 不同粒径免疫超顺磁微球对总IgE的检测效果比较
• 2.3 检测血清IgE的最适免疫超顺磁微球用量分析
• 2.3.1 200nm免疫超顺磁微球的最适用量分析
• 2.3.2 1μm免疫超顺磁微球的最适用量分析
• 2.4 螨虫特异性抗体的免疫超顺磁微球检测
• 2.5 IgE浓度对免疫超顺磁微球检测的影响
• 2.6 免疫超顺磁微球检测获得的OD值与总IgE浓度的关系
• 2.7 户尘螨过敏原免疫超顺磁微球制备及对户尘螨过敏原特异性抗体（sIgE）检测试验
• 3. 小结与讨论
• 第五章 转基因生物中靶基因的初步检测
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 靶基因的克隆
• 1.2.1 植物总DNA提取（CTAB法）及纯度测定
• 1.2.2 靶基因的扩增及凝胶电泳鉴定
• 1.2.3 PCR产物割胶回收
• 2法）'>1.2.4 大肠杆菌感受态细胞制备（CaCl₂法）
• 1.2.5 Ubi-1启动子序列的克隆鉴定
• 1.3 超顺磁微球的寡聚核苷酸探针的制备
• 1.4 SYBR Green Ⅰ含量对双链DNA检测值的影响
• 1.5 不同磁珠探针的检测效果分析
• 2. 结果与分析
• 2.1 玉米基因组DNA
• 2.2 目的片段的扩增及凝胶电泳鉴定
• 2.3 玉米ZmUbi-1启动子鉴定
• 2.4 SYBR Green Ⅰ含量对双链DNA检测值的影响
• 2.5 不同磁珠探针的检测效果分析
• 3. 小结与讨论
• 参考文献