论文题目: 主动靶向肿瘤细胞的转铁蛋白-PEG-rHuTNF-α复合物的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 药剂学
作者: 姜嫣嫣
导师: 裴元英
关键词: 聚乙二醇,重组人肿瘤坏死因子,转铁蛋白,转铁蛋白受体,主动靶向,药物动力学,抗肿瘤活性
文献来源: 复旦大学
发表年度: 2005
论文摘要: 人体内存在于细胞膜或胞内蛋白上的受体可特异性地识别配体分子,并将其导入到体内特定的位置。由于配体无毒、无免疫原性、可生物降解,可利用配体与药物形成复合物将药物特异性地导入体内某一部位。因此,配体-受体介导的主动靶向给药系统备受关注。转铁蛋白(Tf)是一种参与机体铁离子运输的糖蛋白。转铁蛋白和转铁蛋白受体介导的内吞作用是生物细胞最具特点的转运过程之一。由于转铁蛋白受体在肿瘤细胞和快速增殖的细胞表面高度表达,已有研究将转铁蛋白作为配体一受体介导药物传递系统的导向基团来治疗癌症。 蛋白质和多肽药物的聚乙二醇(PEG)化可使药物半衰期延长,促进药物被动靶向肿瘤组织。重组人肿瘤坏死因子(rHuTNF-α)是一抗肿瘤细胞因子,对各种肿瘤细胞有直接细胞毒作用,可激活机体的抗肿瘤免疫反映,可引起肿瘤的缺血性坏死。若希望通过静脉给药获得明显的抗肿瘤效果,则必须持续大剂量注射,进而导致严重的毒副作用。PEG化rHuTNF-α可延长药物的半衰期,增加肿瘤组织药物的蓄积和提高抗肿瘤活性。 为进一步提高PEG-rHuTNF-α的肿瘤靶向作用,减小给药剂量,改善治疗效果,本研究以具有双功能基团的NHS-PEG-MAL为“桥梁”,将Tf与PEG化rHuTNF-α结合,形成Tf-PEG-rHuTNF-α复合物。这种复合物具有主动靶向和聚乙二醇被动靶向的双重功能。 由于rHuTNF-α价格昂贵,本研究首先选择β-乳球蛋白B(LG)为模型蛋白,探讨将Tf与蛋白质连接的可能性以及靶向肿瘤细胞的效果。在Tf-PEG-LG的合成获得成功的基础上,我们成功地将PEG化的rHuTNF-α与Tf进行共价连接,获得具有主动和被动靶向肿瘤细胞双重功能的Tf-PEG-rHuTNF-α复合物。 合成反应的第一步是PEG化LG或PEG化rHuTNF-α,然后通过PEG一端的马来酰亚胺基团(MAL)将MAL-PEG-LG或MAL-PEG-rHuTNF-α与巯基化的Tf连接形成Tf-PEG-LG或Tf-PEG-rHuTNF-α。整个反应过程均在室温或4℃下,中性缓冲液中进行,反应条件温和,适合不稳定蛋白质类药物的修饰。 LG和rHuTNF-α分别被不同摩尔比的PEG修饰。不同反应时间下,进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定。采用Image Master图象分析系统定量凝胶中游离蛋白质,评价蛋白质的PEG化程度;结果显示SDS-PAGE法可使游离蛋白质与PEG化蛋白质达到完全分离。蛋白质的PEG化程度随PEG量和反应时间的增加而提高。
论文目录:
中文摘要
ABSTRACT
前言
第一章 MAL-PEG-LG和MAL-PEG-rHuTNF-α的合成、分离和纯化
一、蛋白质和PEG的含量测定
1 材料与仪器
2 方法
2.1 LG的含量测定(Brafofd法)
2.2 rHuTNF-α的含量测定(Braford法)
2.3 NHS-PEG-MAL含量测定(两相法)
3 结果与讨论
3.1 蛋白质含量测定
3.2 NHS-PEG-MAL含量测定
二、PEG化LG的合成、分离和纯化
1 材料与仪器
2 方法
2.1 单因素考察LG与NHS-PEG-MAL的连接条件
2.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法考察连接反应程度
2.3 图象分析系统测定LG的PEG修饰程度
2.4 凝胶过滤色谱法分离纯化MAL-PEG-LG
3 结果与讨论
3.1 MAL-PEG-LG的合成和SDS-PAGE分析
3.2 图象分析系统测定LG的PEG修饰度
3.3 凝胶过滤色谱法分离MAL-PEG-LG
三、PEG化rHuTNF-α的合成、分离和纯化
1 材料与仪器
2 方法
2.1 单因素考察rHuTNF-α与NHS-PEG-MAL的连接条件
2.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法考察连接反应程度
2.3 图象分析系统测定rHuTNF-α的PEG修饰程度
2.4 灌注色谱法分离纯化MAL-PEG-rHuTNF-α
3 结果与讨论
3.1 SDS-PAGE分析MAL-PEG-rHuTNF-α
3.2 PEG化rHuTNF-α的修饰程度分析
3.3 反应终产物的分离纯化
本章小结
参考文献
第二章 Tf-PEG-LG和Tf-PEG-rHuTNF-α的制备、分离和纯化
1 材料与仪器
2 实验方法
2.1 Tf含量测定标准曲线(Bradford法)
2.2 Tf的巯基化
2.3 ~(125)I-Tf-SH的制备
2.4 ~(125)I-Tf-PEG-LG的制备
2.5 ~(125)I-Tf-PEG-rHuTNF-α的制备
3 结果与讨论
3.1 Tf含量测定标准曲线
3.2 Tf的巯基化
3.3 ~(125)I-Tf-SH的制备
3.4 ~(125)I-Tf-PEG-LG的制备
3.5 ~(125)I-Tf-PEG-rHuTNF-α的制备
本章小结
参考文献
第三章 转铁蛋白-PEG-蛋白质复合物靶向肿瘤细胞机理的初步探讨
一、Tf、LG和rHuTNF-α放射性~(125)I的标记
1 材料与仪器
2 实验方法
2.1 ~(125)I-Tf(Fe)_2的制备
2.2 ~(125)I-LG的制备
2.3 ~(125)I-rHuTNF-α的制备
3 结果与讨论
3.1 ~(125)I-Tf(Fe)_2的制备
3.2 ~(125)I-LG的制备
3.3 ~(125)I-rHuTNF-α的制备
二、~(125)I-Tf(Fe)_2与细胞饱和结合研究
1 材料与仪器
2 实验方法
2.1 细胞培养
2.2 细胞与~(125)I-Tf(Fe)_2结合动力学试验
2.3 细胞浓度对~(125)I-Tf(Fe)_2与受体结合的影响试验
2.4 细胞与~(125)I-Tf(Fe)_2结合饱和试验
3 结果与讨论
3.1 细胞与~(125)I-Tf(Fe)_2结合动力学试验
3.2 细胞浓度对~(125)I-Tf(Fe)_2与受体结合的影响试验
3.3 细胞与~(125)I-Tf(Fe)_2结合饱和试验
三、Tf-PEG-LG复合物与肿瘤细胞结合的特异性和亲和力评价
1 材料与仪器
2 实验方法
2.1 肿瘤细胞与PL结合试验
2.2 肿瘤细胞与TPL结合试验
2.3 TPL竞争抑制肿瘤细胞与~(125)I-Tf(Fe)_2结合试验
3 结果与讨论
3.1 肿瘤细胞与PL结合试验
3.2 肿瘤细胞与TPL结合试验
3.3 TPL竞争抑制肿瘤细胞与~(125)I-Tf(Fe)_2结合试验
四、Tf-PEG-rHuTNF-α复合物与肿瘤细胞结合的特异性和亲和力评价
1 材料与仪器
2 实验方法
2.1 肿瘤细胞与PT结合试验
2.2 肿瘤细胞与TPT结合试验
2.3 TPT对肿瘤细胞与~(125)I-Tf(Fe)_2结合的竞争抑制试验
3 结果与讨论
3.1 肿瘤细胞与PT结合试验
3.2 肿瘤细胞与TPT结合试验
3.3 TPT竞争抑制肿瘤细胞与~(125)I-Tf(Fe)_2结合
本章小结
参考文献
第四章 Tf-PEG-rHuTNF-α复合物体内药物动力学和组织分布研究
1 药品、材料、仪器与动物
2 实验方法
2.1 大鼠体内药动学研究
2.2 S-180实体瘤小鼠体内药物动力学、组织分布研究和靶向性评价
3 结果与讨论
3.1 Tf-PEG-rHuTNF-α和MAL-PEG-rHuTNF-α在大鼠体内的药动学研究
3.2 S-180实体瘤小鼠体内药物动力学、组织分布和靶向性评价
本章小结
参考文献
第五章 Tf-PEG-rHuTNF-α复合物体内药效学初步研究
1 药品、材料与动物
2 实验方法
2.1 给药剂量初步摸索
2.2 抗肿瘤活性研究
3 结果与讨论
3.1 确定给药剂量
3.2 Tf-PEG-rHuTNF-α复合物的抗肿瘤活性
本章小结
参考文献
全文结论与展望
综述
论文
致谢
论文独创性声明
论文使用授权声明
发布时间: 2005-09-19
参考文献
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