论文摘要
目的:克隆人工IL-17F基因,在大肠杆菌中重组表达并构建人IL-17F转基因细胞和真核稳定表达,研究其生物学活性。 方法:分离人外周血单个核细胞,经PHA刺激后,提取细胞总RNA,根据GenBank公布的人IL-17F cDNA序列设计并合成一对引物,采用RT-PCR技术克隆人IL-17F基因,将其亚克隆到pUCm-T载体并鉴定。以测序正确的pUCm-T/hIL-17F为模板,PCR扩增出目的基因片段,并分别正向插入原核表达载体pGEX-5X-3和逆转录病毒载体pSIV-1,构建重组表达载体pGEX-5X-3/hIL-17F和pSIV-1/hIL-17F。重组原核表达载体pGEX-5X-3/hIL-17F导入大肠杆菌BL21并经IPTG诱导表达包涵体融合蛋白,纯化后进行Western印迹鉴定。MTT法分析GST-hIL-17F纯品蛋白对人脐静脉内皮细胞ECV304的生长抑制作用和ELISA法检测其对ECV304内皮细胞表达IL-6、IFNγ和TNF-α的生物学作用,并采用鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）法分析其对血管形成的影响。重组逆转录病毒载体pSIV-1/hIL-17F与辅助病毒载体pHIT456和pHIT60混合后,脂质体法共转染包装细胞293T细胞。获得的具有感染能力的成熟重组逆转录病毒感染SMMC-7721肝癌细胞,经G418加压筛选获得抗性细胞株,并RT-PCR、Western blot检测目的基因的转录和表达。
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