棉花离体培养再生体系的研究及抗黄萎病转基因棉花植株的培育

论文摘要

细胞工程和基因工程的迅速发展和广泛应用为植物的遗传改良开拓了广阔的前景。植物抗病基因工程是植物基因工程的一个分支，它是将外源抗病基因通过各种遗传方法导入到植物基因组中并培育抗病品种。棉花是我国第一大经济作物，棉花黄萎病被称为棉花的“癌症”，本研究以湖南重要的优良品种湘棉10号、湘棉15号为研究材料，采用花粉管通道法将溶菌酶基因导入两品种均获得了抗黄萎病的棉花植株，同时进行了湘棉10号离体培养再生体系建立的研究为农杆菌介导转化外源基因奠定了基础。研究结果如下：1湘棉10号再生体系建立的研究（1）外植体类型是影响棉花愈伤组织诱导的重要因素。不同外植体在相同激素组合下，愈伤诱导率不同。湘棉10号的愈伤组织诱导率大小顺序为下胚轴＞子叶＞胚根。（2）以下胚轴为外植体，通过愈伤组织的诱导、继代和分化，摸索出愈伤组织的诱导、继代和分化的最适基本培养基是MSB；愈伤组织的诱导、继代和分化的最适碳源是葡萄糖；最适诱导、继代和分化培养基为MSB+ZT0.1mg／L；不同培养基和激素配比的成苗率不同，SH+IAA0.2mg／L+KT0.2mg／L成苗率最高达13.6％；生根的最适培养基是MS+IAA0.1mg／L，生根率高达100％。（3）愈伤组织的诱导和继代表明，愈伤组织形成的快慢、多少与激素、外植体种类、温度和基因型有关。2，4-D的添加有利于愈伤组织的诱导和形成但未能直接诱导获得胚性愈伤组织，ZT的单独使用则可直接诱导获得少量的胚性愈伤组织；同时研究表明温度影响愈伤组织的诱导，最适温度为28℃左右。（4）在防褐的研究中发现对基本培养基的改良，选择适宜的激素组合以及添加防褐物质如活性碳，PVP等都对降低愈伤组织的褐化有明显的作用。KT+6-BA激素组合可以明显降低褐化，而KT、IAA、6-BA三种激素的单独应用效果对愈伤组织的褐化改善不明显。2花粉管通道法获得转溶菌酶基因植株以湘棉10号、湘棉15号为研究材料，采用花粉管通道法将溶菌酶基因导入，在遗传转化中，摸索出了该方法转化的较佳位置是从果枝第2果台开始至第6果台，转化时间应选择开花约24小时的自交棉花进行注射，其成铃率较高而且收获的拟转化种子数量最多，注射方式以对准中轴胎座的中部位置垂直插入子房最佳，其转化率达9％而且此种注射方式减少对子房的伤害提高了成铃率。采用抗生素筛选最后筛选得到23株抗卡那霉素湘棉10号植株和9株抗G418湘棉15号植株。经分子生物学方法PCR，PCR-SOUTHERN检测，结果发现：23株抗卡那霉素湘棉10号植株中1株不含选择标记基因NPTⅡ只含溶菌酶基因，同时获得4株只含选择标记基因不含溶菌酶基因植株，证实其他18株转溶菌酶基因棉花中溶菌酶基因和选择标记基因NPTⅡ均已整合在棉花基因组中，9株抗G418的湘棉15号植株中2株只含选择标记基因不含溶菌酶基因植株，证实其他7株转溶菌酶基因棉花中溶菌酶基因和选择标记基因NPTⅡ均已整合在棉花基因组中。3转基因植株初步的抗性测试采用菌液浇根法和针刺叶片喷洒法两种方法对转基因植株进行初步的抗黄萎病的抗性测试，黄萎病菌株由河北植保所提供，菌株培养后对转基因植株和对照植株的根或叶片进行处理，然后观察统计，两种方法的实验结果都表明经菌处理后转基因植株生长正常，而对照植株叶片先出现褐斑，然后变黄枯萎，而且生长状态差，几乎不生长。初步表明转溶菌酶基因的棉花植株对黄萎病具有抗性。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
• 1 npt-Ⅱ基因和溶菌酶基因的概述
• 1.1 npt-Ⅱ基因的筛选机理及应用
• 1.2 溶菌酶及其应用
• 2 花粉管通道法的机理及优缺点
• 2.1 花粉管通道法的机理
• 2.2 花粉管通道法的优缺点
• 2.2.1 优点
• 2.2.2 缺点
• 3 棉花再生体系建立的研究现状
• 3.1 材料的选择
• 3.2 外植体的选择
• 3.3 培养条件
• 3.4 愈伤组织的诱导及继代增殖
• 3.5 胚性愈伤组织的分化和植株再生移栽
• 4 棉花黄萎病的研究进展
• 4.1 棉花黄萎病的致病情况及危害
• 4.2 棉花黄萎病的防治措施
• 4.2.1 种植抗（耐）病品种
• 4.2.2 种子处理
• 4.2.3 药剂防治
• 4.2.4 平衡施肥
• 4.2.5 适期晚播
• 4.2.6 结铃早晚与发病
• 4.2.7 轮作倒茬
• 4.2.8 清洁田园
• 4.2.9 施无病粪肥
• 4.3 棉花抗黄萎病新品种选育进展
• 4.4 棉花抗黄萎病的分子育种
• 4.4.1 抗黄萎病基因的分子标记辅助育种
• 4.4.1.1 RAPD的应用
• 4.4.1.2 AFLP标记应用
• 4.4.1.3 棉花黄萎病抗性基因的克隆
• 4.4.2 棉花黄萎病转基因的育种
• 5 本课题立项依据和研究目的
• 第二章 棉花离体培养再生体系建立的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 培养基
• 1.3 方法
• 1.4 培养条件
• 1.5 统计方法
• 2 结果与分析
• 2.1 愈伤组织的诱导、继代和分化
• 2.1.1 愈伤组织的诱导
• 2.1.1.1 外植体的选择
• 2.1.1.2 培养基的筛选
• 2.1.1.2.1 基本培养基的选择
• 2.1.1.2.2 不同激素及激素组合的筛选
• 2.1.1.3 温度对愈伤组织的诱导的影响
• 2.1.1.4 不同碳源对愈伤组织的诱导的影响
• 2.1.2 愈伤组织的继代
• 2.1.2.1 胚性愈伤组织的选择继代
• 2.1.2.2 胚性愈伤组织的增殖
• 2.1.2.3 不同碳源对愈伤组织继代的影响
• 3愈伤组织的继代的影响'>2.1.2.4 AgNO₃愈伤组织的继代的影响
• 2.1.3 胚性愈伤组织的分化和植株再生
• 2.1.3.1 胚性愈伤组织的分化培养基的选择
• 2.1.3.2 不同碳源对胚性愈伤组织分化的影响
• 2.1.3.3 不同培养基和激素对试管苗生长的影响
• 2.1.4 再生植株的生根及移栽
• 2.2 组织培养中降低褐化的研究
• 2.2.1 激素组合的选择
• 2.2.2 基本培养基的改良
• 2.2.3 添加防褐物质
• 3 小结与讨论
• 3.1 激素对愈伤组织的诱导和继代影响
• 3.2 胚性愈伤组织的形成及胚状体萌发是植株再生的关键.
• 3.3 降低褐变是棉花组织培养成功的重要方面之一
• 3.4 植株再生过程中有待解决的问题
• 第三章 花粉管通道法获得转溶菌酶基因抗病棉花
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 基因
• 1.1.2 材料
• 1.1.3 试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 质粒DNA的大量制备及纯化
• 1.2.1.1 在丰富培养基中扩增质粒
• 1.2.1.2 细菌的收获和裂解
• 1.2.2 遗传转化方法
• 1.2.3 抗生素筛选转基因棉花的研究
• 1.2.3.1 卡那霉素对拟转基因湘棉10号棉花种子的处理
• 1.2.3.2 卡那霉素涂抹叶片试验
• 1.2.3.3 G418处理棉花离体叶片
• 1.2.4 PCR检测
• 1.2.4.1 棉花DNA提取和纯化
• 1.2.4.2 基因扩增反应体系
• 1.2.5 外源基因的PCR-southern印迹杂交检测
• 1.2.5.1.转膜
• 1.2.5.2.杂交
• 1.2.5.2.1 探针的制备及浓度检测
• 1.2.5.2.2 杂交
• 1.2.5.2.3 洗膜
• 1.2.5.2.4 显色
• 2 结果与分析
• 2.1 棉花的遗传转化
• 2.1.1 转化位置的确定
• 2.1.2 转化时间的确定
• 2.1.3 注射方式的确定
• 2.2 抗生素筛选转基因植株
• 2.2.1 卡那霉素对转基因棉花种子检测临界浓度的确定
• 2.2.2 湘棉15号棉花叶片对卡那霉素敏感性的测定
• 2.2.3 转基因材料叶片和对照材料叶片对G418的反应
• 2.2.4 转化植株的获得
• 2.3 转基因棉花分子生物学鉴定
• 2.3.1 湘棉10号植株总DNA的电泳
• 2.3.2 PCR检测结果
• 2.3.2.1 溶菌酶基因PCR扩增检测
• 2.3.2.2 NPTⅡ基因PCR扩增检测
• 2.3.2.3 NPTⅡ基因和溶菌酶基因的PCR扩增结果统计
• 2.3.3 PCR-southern印迹杂交检测
• 2.3.3.1 探针浓度的检测
• 2.3.3.2 PCR-Southern结果
• 3 讨论
• 3.1 棉花的遗传转化方法
• 3.1.1 影响转化率的因素
• 3.1.2 花粉管通道法遗传转化的操作程序
• 3.2 选择适宜的卡那霉素浓度是卡那霉素浸种筛选转基因棉花的关 键
• 3.3 棉花总DNA的提取优化
• 3.4 转溶菌酶基因棉花中外源基因的分子鉴定及其整合特点
• 第四章 转基因植株抗黄萎病的初步鉴定
• 1 材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 菌种
• 1.3 试剂
• 2 方法
• 2.1 菌液浇根法
• 2.1.1 方法和步骤
• 2.1.1.1 用于棉苗培育的塑料营养钵的准备
• 2.1.1.2 棉苗培育
• 2.1.1.3 病菌培养与孢子悬浮液的配制
• 2.1.1.4 接种方法
• 2.2 针刺叶片喷洒法
• 2.2.1 针刺处理
• 2.2.2 培养病菌
• 2.2.3 喷洒菌液
• 3 结果
• 3.1 菌液浇根法第25统计天进行病情调查
• 3.2 针刺叶片喷洒法处理植株一周后的生长情况
• 4 讨论
• 参考文献
• 附图
• 致谢
• 作者简介