牛传染性鼻气管炎病毒gC～-/LacZ～+基因缺失毒株的构建及gD糖蛋白的截短表达与活性检测

论文摘要

牛传染性鼻气管步（Infectious Bovine Rhinotracheitis，IBR）是由牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious Bovine Rhinotracheitis virus，IBRV）引起的一种牛的急性、热性、接触性传染病，临床上主要以高热、呼吸困难、鼻炎、窦炎和上呼吸道炎症为特征，还能引起母牛流产和死胎、肠炎和小牛脑炎，有时发生眼结膜炎和角膜炎。该病在世界范围内流行，并且每年都给养牛业造成巨大的经济损失，鉴于传统疫苗存在的弊端及该病毒的特点，近年来对活病毒载体疫苗的研究受到了更大的关注。本研究构建了一株牛传染性鼻气管炎病毒gC基因缺失的重组病毒，为构建表达外源基因的IBRV重组病毒及研制牛病活载体疫苗奠定了基础。同时截短表达了IBRV的gD糖蛋白，所表达的蛋白具有良好的反应性，可用于IBRV诊断试剂与亚单位疫苗的研究。本实验根据牛传染性鼻气管炎病毒全基因组序列（基因登陆号为NC 001847）设计引物，用PCR扩增gC基因上游和下游各1.4kb的片段作为同源重组臂，分别连入pMD18-T载体，并命名为pUgC和pDgC。限制性酶切和测序鉴定正确后，用XbaⅠ和NsiⅠ消化pUgC，将得到的的上游重组臂定向克隆于pdTK质粒，pdTK质粒中含有LacZ基因表达盒，可以通过蓝白斑筛选及酶切鉴定得到阳性克隆质粒，再用AsuⅡ和KpnⅠ消化此质粒，回收带有上游重组臂的大片段后与用AsuⅡ和KpnⅠ消化pDgC得到的下游重组臂连接得到pdgC-／LacZ+重组质粒转移载体。其中LacZ基因正好位于gC启动子的下游，LacZ基因编码氨基酸前面有25个由gC起始密码子ATG在内的75个核苷酸编码的氨基酸残基。采用磷酸钙-DNA沉淀法将经AsuⅡ线性化的pdgC-／LacZ+质粒转移载体和IBRV全基因组DNA共转染牛鼻甲细胞（BT），待细胞病变达80％后收获病毒，按1：6倍比稀释病毒，接种MDBK细胞单层，用1％甲基纤维素限定细胞病变。待出现明显的病毒蚀斑后，用加有X-gal的1％低熔点琼脂糖覆盖后挑取病毒蓝斑，经6代篮色蚀斑筛选纯化及PCR鉴定得到稳定增殖的重组病毒rIBRV gC-／LacZ+。gD糖蛋白位于病毒囊膜及感染细胞的表面，其作为抗原产生的抗体中和病毒效果最好，成为研制亚单位疫苗的首选蛋白。本实验利用生物学软件DNAStar分析，以IBRV（Bartha Nu／67）基因组DNA为模板，PCR扩增出gD基因943bp的片段，然后将此目的片段定向克隆到pET30a表达载体中。经酶切和测序鉴定得到阳性重组质粒pET30a-tgD，然后将其转化BL21表达菌，经IPTG诱导得到部分可溶性表达的重组蛋白（tgD）。采用Ni柱亲和层析法在非变性的条件下成功地纯化了重组蛋白（tgD），纯化的重组蛋白浓度为0.852mg／ml，纯度为85.2％。Western blot和ELIsA检测证明纯化后的重组蛋白（tgD）可以被牛传染性鼻气管炎病毒抗血清所识别，具有良好的反应性，可以进一步开发研制牛传染性鼻气管炎诊断试剂及亚单位疫苗。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 引言
• 1.1 牛传染性鼻气管炎简介
• 1.1.1 牛传染性鼻气管炎发展简史
• 1.1.2 牛传染性鼻气管炎病毒的形态与分子特征
• 1.1.3 牛传染性鼻气管炎病毒编码蛋白概述
• 1.1.4 牛传染性鼻气管炎诊断
• 1.2 病毒活载体疫苗的研究进展
• 1.2.1 痘病毒活载体
• 1.2.2 腺病毒活载体
• 1.2.3 疱疹病毒活载体
• 1.2.3.1 牛疱疹病毒活载体
• 1.2.3.2 牛疱疹病毒作为活载体的优势
• 1.2.3.3 构建牛疱疹病毒活病毒载体重组病毒的策略
• 1.2.3.4 牛疱疹病毒活病毒载体重组病毒的应用
• 1.2.3.5 牛疱疹病毒活病毒载体研究中遇到的问题
• 1.3 研究目的和意义
• -/LacZ⁺基因缺失毒株的构建与鉴定'>第二章 牛传染性鼻气管炎病毒gC^-/LacZ⁺基因缺失毒株的构建与鉴定
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 毒株和细胞
• 2.1.2 载体和试剂
• 2.1.3 引物
• 2.1.4 MDBK细胞的培养与IBRV基因组DNA的制备
• 2.1.5 同源重组臂的克隆及其转移载体的构建与鉴定
• 2.1.6 带有LacZ基因的gC基因缺失转移载体的构建与鉴定
• -/LacZ⁺转移载体质粒的大量提取与纯化'>2.1.7 pdgC^-/LacZ⁺转移载体质粒的大量提取与纯化
• 2.1.8 牛鼻甲细胞的培养与病毒DNA的转染
• 2.1.9 重组病毒的筛选和纯化
• 2.1.10 重组病毒的PCR鉴定
• 2.1.11 重组病毒的测序鉴定
• 50的测定'>2.1.12 重组病毒TCID₅₀的测定
• 2.2 结果
• 2.2.1 同源重组臂的克隆及其转移载体的鉴定
• 2.2.2 带有lacZ基因的gC基因缺失转移载体的鉴定
• 2.2.3 重组病毒的筛选
• 2.2.4 重组病毒的PCR鉴定
• 2.2.5 重组病毒的测序鉴定
• 50的测定'>2.2.6 重组病毒TCID₅₀的测定
• 2.3 讨论
• 2.3.1 转染方法的选择
• 2.3.2 重组病毒的筛选和纯化
• 2.3.2 重组病毒的生物学特性
• 第三章 牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的截短表达与活性检测
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 克隆质粒、菌株及病毒、细胞与血清
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 病毒基因组DNA的提取
• 3.1.4 引物设计与合成
• 3.1.5 gD基因表达载体的构建与鉴定
• 3.1.6 gD重组蛋白表达条件的优化
• 3.1.7 表达产物的纯化
• 3.1.8 Western blot检测
• 3.1.9 间接ELISA检测蛋白活性
• 3.2 结果
• 3.2.1 PCR及表达载体的鉴定
• 3.2.2 表达诱导条件的优化
• 3.2.3 表达蛋白在细菌中的存在形式及纯化
• 3.2.4 Western blot分析结果
• 3.2.5 间接ELISA检测结果
• 3.3 讨论
• 第四章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历