A型口蹄疫病毒多基因重组腺病毒载体的构建

论文摘要

口蹄疫（Foot-and-mouth disease, FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus, FMDV）引起偶蹄动物的急性、烈性、接触性传染病。目前,在经济不发达国家,使用传统灭活疫苗免疫是控制和根除FMD的主要手段。但是传统疫苗存在很多不足之处,包括热不稳定性,免疫持续期短,疫苗成本高,疫苗的生产需要严格的生物安全防护设施,而且存在疫苗灭活不彻底而散毒的问题。这就促使人们寻求一种更加安全有效的FMD疫苗。新型分子疫苗学技术的发展为FMD分子疫苗的研究提供了新的思路。重组病毒载体疫苗是新型分子疫苗研究的一个重要方面。利用腺病毒为载体构建表达FMDV空衣壳的病毒载体疫苗是目前国内外研究的一个热点。本研究通过体外连接的方法将含有A型FMDV P1-2A和3C或3ABC基因的目的基因表达盒插入到人5型腺病毒骨架载体中,构建成功了FMDV基因重组腺病毒载体,为FMD腺病毒活载体疫苗的研究奠定了基础。首先,从带有A型FMDV P1-2A和3ABC基因的两个重组质粒中扩增得到P1-2A、3C和3ABC基因,亚克隆到pGEM-T Easy载体上,然后用限制性内切酶切取目的片段,定向连接插入穿梭载体pShuttle2,得到两株重组穿梭质粒pSh-P12A3C和pSh-P12A3ABC。序列测定结果证明,目的基因正确连接入穿梭质粒,P12A3C和P12A3ABC基因序列大小分别为2931 bp和3552 bp,与亲本毒株序列比较发现在3C和3ABC分别有两个和四个编码氨基酸发生改变,同源性分别为99.7%和99.6%。用限制性内切酶I-CeuⅠ和PI-SceⅠ酶切穿梭质粒pSh-P12A3C和pSh-P12A3ABC,回收目的基因表达盒,通过体外连接法将目的基因表达盒插入到BD Adeno-X Virus DNA骨架中。用SwaⅠ处理连接产物后转化感受态细胞,挑取阳性克隆,经PCR扩增、酶切和测序鉴定获得两个正确的重组腺病毒质粒,分别命名为A-P12A3C和A-P12A3ABC。用限制性内切酶PacⅠ线性化重组腺病毒质粒A-P12A3C和A-P12A3ABC,回收后借助脂质体转染293细胞,观察一周。其中A-P12A3ABC转染的细胞传到第2代时,观察到致细胞病变作用（CPE）;但A-P12A3C转染的细胞连续传到第4代时出现明显CPE。病变细胞肿大变圆,呈葡萄串样。将出现病变的细胞连续传10代,测定其毒价分别为2.4×10-8/0.2mL和1×10-8/0.2mL。用间接荧光抗体法和双抗体夹心ELISA方法检测到目的基因表达,PCR扩增证明重组腺病毒稳定携带目的基因。通过电子显微镜也观察到发生CPE的细胞裂解上清中的重组腺病毒粒子,说明已经成功的构建了表达A型FMDV全衣壳蛋白的重组腺病毒。本实验为A型FMDV多基因重组腺病毒活载体疫苗的研究奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 第一部分 文献综述
• 1 口蹄疫
• 2 口蹄疫病毒及其基因组结构和功能
• 2.1 口蹄疫病毒
• 2.2 口蹄疫病毒的基因组结构和功能
• 2.2.1 5'-UTR 和3'- UTR 的结构和功能
• 2.2.2 ORF 的结构和功能
• 3 口蹄疫病毒基因工程疫苗的研究进展
• 3.1 亚单位疫苗
• 3.2 转基因植物疫苗
• 3.3 基因缺失疫苗
• 3.4 合成肽疫苗
• 3.5 蛋白质载体疫苗
• 3.6 活载体疫苗
• 3.6.1 痘病毒载体
• 3.6.2 腺病毒载体
• 3.6.3 疱疹病毒载体
• 3.6.4 其他病毒载体
• 3.6.5 重组载体细菌活疫苗
• 3.7 核酸疫苗
• 第二部分 研究报告
• 第一章 A 型口蹄疫病毒多基因腺病毒穿梭质粒的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 质粒和菌株
• 1.2 主要试剂和酶
• 1.3 引物设计与合成
• 1.4 A 型口蹄疫病毒P12A、3ABC、3C 目的基因的PCR 扩增
• 1.5 片段的克隆与鉴定
• 1.5.1 PCR 产物的纯化与回收
• 1.5.2 目的基因与pGEM-T Easy 载体的连接
• 1.5.3 感受态细胞的制备（在严格无菌条件下进行）
• 1.5.4 转化
• 1.5.5 挑斑
• 1.5.6 重组质粒的提取
• 1.5.7 重组质粒的鉴定
• 1.6 腺病毒穿梭载体的构建
• 1.6.1 P1-2A 和3C 或3ABC 片段插入穿梭载体
• 1.6.2 转化感受态细胞
• 1.6.3 质粒DNA 的提取
• 1.6.4 重组腺病毒穿梭载体的鉴定
• 2 结果
• 2.1 T-P1、T-3C、T-3ABC 质粒的鉴定
• 2.1.1 T-P1、T-3C、T-3ABC 质粒的PCR 鉴定
• 2.1.2 T-P1、T-3C、T-3ABC 质粒的酶切鉴定
• 2.2 重组腺病毒穿梭载体的PCR 和酶切鉴定
• 2.3 穿梭质粒的测序鉴定
• 3 讨论
• 第二章 体外连接法构建A 型口蹄疫病毒多基因重组腺病毒载体
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 主要试剂和酶
• 1.3 体外连接法构建重组腺病毒质粒
• 1.3.1 酶切重组的穿梭质粒
• 1.3.2 构建重组腺病毒质粒
• 1.4 重组腺病毒质粒的大量制备
• 2 结果
• 2.1 重组腺病毒质粒的PCR 鉴定
• 2.2 重组腺病毒质粒的酶切鉴定
• 2.3 重组腺病毒质粒的测序结果
• 3 讨论
• 第三章 重组腺病毒质粒转染HEK293 细胞产生重组腺病毒
• 1 材料与方法
• 1.1 细胞
• 1.2 试剂
• 1.3 培养液
• 1.4 293 细胞的培养
• 1.5 脂质体介导的转染
• 1.6 病毒的传代培养
• 1.7 重组腺病毒的PCR 鉴定
• 1.8 荧光抗体检测目的基因的表达
• 1.9 双抗体夹心检测目的基因的表达
• 1.10 重组腺病毒的电镜观察
• 1.11 重组病毒的毒价测定
• 2 结果
• 2.1 重组腺病毒质粒转染HEK293 细胞
• 2.2 PCR 检测重组病毒
• 2.3 间接荧光抗体法检测目的基因的表达
• 2.4 双抗体夹心ELISA 检测目的基因的表达
• 2.5 电镜观察结果
• 2.6 重组病毒的效价滴定
• 2.6.1 A-P12A3ABC 的病毒滴度
• 2.6.2 A-P12A3C 的病毒
• 3 讨论
• 第四章 全文结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简历
• 导师简介