胆碱酯酶抑制剂加兰他敏对脓毒症炎症反应的作用及其机制研究

论文摘要

脓毒症是创伤、烧伤、休克、感染、外科大手术后常见的并发症,严重者可进一步发展为脓毒症休克、多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunctionsyndrome,MODS）,已成为临床危重病患者的重要死亡原因之一,是当前危重病医学面临的困难问题。由于脓毒症的发病本质是失控性的炎症反应,近年来的药物研究主要为开发炎症介质特异性抑制剂、阻断剂或中和剂,其思路是针对脓毒症的每个具体环节,试图阻止脓毒症的发生和发展。尽管很多在动物实验中取得了满意的结果,但是在临床应用中却大多未能成功。迷走神经是重要的副交感神经,其纤维广泛分布于拥有网状内皮系统的器官,如肝、肺、脾、肾和肠等。除了调节这些内脏活动外,新近研究发现电刺激迷走神经传出支可抑制内毒素血症大鼠肝、脾、心脏组织肿瘤坏死因子α（tumor necrosisfactorα,TNF-α）的合成并降低血清中TNF-α浓度,减少脓毒症休克的发生率;迷走神经递质乙酰胆碱可抑制内毒素刺激的巨噬细胞释放TNF-α、白介素（interleukin,IL）-1β、IL-6及IL-18,却不影响抗炎细胞因子IL-10的合成、释放;迷走神经切除后显著提高了炎症刺激下TNF-α的合成与释放,增强内毒素对实验动物的致死性。这些研究提示兴奋迷走神经可降低全身炎症反应----由于其递质为乙酰胆碱,故称胆碱能抗炎通路。研究表明,α7烟碱型乙酰胆碱受体（α7nAChR）在巨噬细胞、单核细胞、内皮细胞等表面具有表达,起着联系胆碱能系统和固有免疫系统的重要作用。胆碱能抗炎通路的提出,为我们提供了一种新的寻找脓毒症治疗方法的思路----激活胆碱能抗炎通路,激活胆碱能抗炎通路可以有两种途径,一种是直接电刺激迷走神经,一种是通过药物作用。进一步研究中枢胆碱能系统在胆碱能抗炎通路中的作用,发现激动中枢毒草碱型（M）乙酰胆碱受体（特别是M1亚型）或增加中枢乙酰胆碱释放（激动突触前M2自调节受体）,可激活胆碱能能抗炎途径,增加迷走神经传出活动并降低循环TNF释放;而直接激动外周M受体则不能产生抗炎作用。激动中枢胆碱能系统可以有多种途径,包括使用乙酰胆碱前体、乙酰胆碱酯酶抑制剂（acetylcholinesterase inhibitor,AchEI）、选择性胆碱能受体激动剂、或是乙酰胆碱释放调节剂。其中AchEI是目前公认治疗Alzheimer病（Alzheimer’s disease,AD）有效,且应用与研究较多的药物,也是迄今为止唯一一类通过美国食品药品管理局批准用于治疗AD的药物。其中加兰他敏（galantamine）除了抑制乙酰胆碱的降解外,还可以刺激脑内神经细胞释放更多的乙酰胆碱,这是该类药物中唯一具有这一机制的药物,其有效成分最初是从一种植物中提取而出的,目前已经可以通过化学方法来合成,美国食品药品管理局于2001年批准了加兰他敏对阿尔茨默痴呆小剂量到中剂量的治疗,目前已进入国内用于临床。本研究采用内毒素腹腔感染大鼠及体外细胞培养方法,研究加兰他敏对感染时炎症反应的影响及其作用机理,探索临床脓毒症治疗的新的途径。实验分两部分:第一部分为胆碱酯酶抑制剂加兰他敏对内毒素腹腔感染大鼠全身炎症反应的影响及作用机理;第二部分为胆碱酯酶抑制剂加兰他敏对内毒素刺激后RAW264.7细胞活化的影响。目的:研究胆碱酯梅抑制剂加兰他敏对内毒素腹腔感染大鼠循环TNF的影响,迷走神经在加兰他敏炎症抑制效应中的作用;并研究加兰他敏对内毒素刺激后巨噬细胞活化的影响,阐述加兰他敏炎症调控作用的机理。方法:第一章加兰他敏对内毒素腹腔感染大鼠循环TNF的影响以及迷走神经在加兰他敏炎症抑制效应中的作用:建立内毒素腹腔感染大鼠动物模型和双侧颈部迷走神经切断动物模型,分别将大鼠分成正常对照组（Contral,n=8）、内毒素组（LPS,n=8）、内毒素+加兰他敏组1（LPS+Gal 1,n=8）、内毒素+加兰他敏组2（LPS+Gal 2,n=8）、内毒素+加兰他敏组3（LPS+Gal 3,n=8）5组,和假手术对照组（Sham,n=8）、迷走神经切断组（Vg,n=8）、迷走神经切断+内毒素组（Vg+LPS,n=8）、迷走神经切断+内毒素+加兰他敏治疗组（Vg+LPS+Gal,n=12）4组,分别测定各组血浆TNF值。统计学分析采用Sigmastat统计软件,组间比较采用ANOVA及Newman-keuls检验分析。P<0.05为统计学显著差异。第二章加兰他敏对内毒素刺激后巨噬细胞活化的影响:采用小鼠单核巨噬细胞白血病细胞株RAW264.7体外培养方式,分别予以不同浓度GLA预孵育,内毒素刺激,进行TNF检测、HMGB-1蛋白Western Blot测定、HMGB-1mRNA检测、p-NF-κB、p-I-κB检测。1.RAW264.7细胞以不同浓度GLA（终浓度10、30、100、300、1000、10000nM）预孵育24h,加入终浓度为100ng/ml的内毒素,继续培养4h,收集上清,测定TNF;2.RAW264.7细胞以不同浓度GLA（终浓度10、30、100、300、1000、10000nM）预孵育24h,加入终浓度为100ng/ml的内毒素继续培养24h,收集上清,用WesternBlot检测HMGB-1蛋白;3.RAW264.7细胞以不同浓度GLA（终浓度10、30、100、300、1000、10000nM）预孵育24h,加入终浓度为100ng/ml的内毒素继续培养24h,收集细胞,提取细胞RNA,进行实时荧光定量PCR扩增,相对定量分析HMGB-1mRNA表达;4.RAW264.7细胞以不同浓度GLA（终浓度10、30、100、300、1000、10000nM）预孵育24h,加入终浓度为100ng/ml的内毒素,继续培养2h,收集细胞,用WesternBlot检测p-NF-κB、p-I-κB。统计学分析采用Sigmastat统计软件,组间比较采用ANOVA及Newman-keuls检验分析。P<0.05为统计学显著差异。结果:第一章内毒素腹腔感染大鼠循环TNF水平明显增高,同时给与加兰他敏可使感染大鼠循环TNF水平明显下降,与内毒素腹腔感染大鼠组相比显著差异（p<0.001）。在实验采用的加兰他敏治疗剂量中,3mg/kg组对内毒素腹腔感染大鼠TNF水平的抑制作用最为显著。迷走神经切断大鼠腹腔感染时,循环TNF水平较假手术对照组升高（p<0.05）,加兰他敏明显降低内毒素腹腔感染大鼠TNF水平（p<0.05）,迷走神经切断减弱加兰他敏的TNF抑制作用。第二章正常培养的RAW264.7细胞TNF分泌量极低,内毒素刺激可使RAW264.7细胞分泌TNF水平显著增加（p<0.001）,加兰他敏在10、30、100、300nM浓度范围内可剂量依赖地抑制TNF释放,加兰他敏300nM可抑制LPS所致TNF释放达30%。正常RAW264.7细胞培养上清中存在HMGB-1蛋白,内毒素刺激后RAW264.7细胞培养上清中HMGB-1蛋白水平显著增高,加兰他敏可抑制内毒素刺激后RAW264.7细胞HMGB-1的细胞外分泌。采用实时荧光定量PCR方法,对RAW264.7细胞HMGB-1mRNA水平进行定量测定,在内毒素刺激后24h,RAW264.7细胞内HMGB-1 mRNA水平没有明显变化,不同剂量的加兰他敏预处理对RAW264.7细胞内HMGB-1 mRNA水平没有明显改变。内毒素刺激后RAW264.7细胞内p-NF-κB,p-I-κB水平均明显增加,表明NF-κB通路激活,不同剂量的加兰他敏预处理能明显下调p-NF-κB,p-I-κB水平,并表现出剂量依赖,且与加兰他敏抑制TNFα分泌的剂量依赖一致,最大抑制效应均在300nM。结论:胆碱酯酶抑制剂加兰他敏可降低腹腔感染大鼠循环TNF水平,迷走神经切除可降低加兰他敏对循环TNF的抑制作用。内毒素能刺激RAW264.7细胞大量产生TNF、HMGB-1,胆碱酯酶抑制剂加兰他敏可降低内毒素刺激的巨噬细胞TNF分泌,减少HMGB-1蛋白分泌水平。加兰他敏对TNF的抑制作用具有明显的量效关系,其最佳剂量（～300nM）与既往对加兰他敏在神经细胞凋亡方面的研究一致。加兰他敏可减低内毒素所致巨噬细胞NF-kappaB信号通路的激活。加兰他敏具有炎症调控作用,可能对临床炎症性疾病如脓毒症的炎症反应失控具有调节甚至治疗作用。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 英文缩略语表
• 目次
• 正文
• 1.引言
• 2.第一章 胆碱酯酶抑制剂加兰他敏对内毒素腹腔感染大鼠循环TNF的影响及作用机理研究
• 2.1 实验材料
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 3.第二章 胆碱酯酶抑制剂加兰他敏对内毒素刺激后RAW264.7细胞活化的影响
• 3.1 细胞株及主要试剂
• 3.2 实验方法
• 3.3 数据显示及统计
• 3.4 结果
• 3.5 讨论
• 4.结论
• 5.参考文献
• 综述一
• 综述二
• 作者简历
• 已发表论文一
• 已发表论文二
• 已发表论文三