家蚕细胞色素P450的基因表达调控研究

论文摘要

细胞色素P450是参与外源和内源化合物合成、分解的一种重要代谢酶系。包括参与杀虫剂和植物次生物质的代谢以及蜕皮激素、保幼激素、性信息素的合成,与昆虫的生长、发育和防御密切相关。为了研究家蚕细胞色素P450 3家族基因与蜕皮激素的代谢关系和细胞色素P450 4家族基因与芸香苷的代谢关系,本研究用Real-time PCR和双荧光检测系统对CYP 3家族和CYP 4家族基因功能和调控机制进行研究,结果如下:采用双跟踪标定定量PCR （dual-spike-in qPCR）方法,检测在蜕皮激素诱导下家蚕中肠和脂肪体内CYP 3基因家族的转录水平。结果表明:与对照相比,在蜕皮激素诱导下家蚕幼虫脂肪体中CYP302, CYP306和CYP339的转录水平分别上升了191.4, 7.4和421倍,在中肠中变化不显著;其余基因转录水平变化不明显或检测不到转录活性。说明CYP339基因最有可能参与家蚕蜕皮激素的代谢,这为进一步研究P450基因与内源物质的关系提供理论基础。选两个代表基因CYP339和CYP306研究与蜕皮激素代谢相关的基因表达调控机制,对其启动子区域的功能进行了分析;构建了含荧光素酶报告基因和启动子不同长度缺失片段（2000bp, 1600bp, 1200bp, 800bp, 400bp左右）的重组质粒,和内参载体pRL-TK共转染BmN细胞,通过蜕皮激素诱导,瞬时表达后用双荧光素酶报告基因检测系统检测启动子活性。功能分析结果表明:CYP306基因5个缺失片段中只有pGL3-306-1, pGL3-306-2具有启动子活性,CYP339基因的5个启动子片段均具转录活性,其中都是长1 600 bp的片段转录活性最高。说明这两个基因的5’调控区在1 200 bp片段与1 600 bp片段之间可能存在转录增强因子的结合位点,而在其上游可能存在转录抑制因子的结合位点。2×10-2, 2×10-3, 2×10-4μg/μL三个浓度的蜕皮激素溶液诱导细胞后,2个基因的10个缺失片段活性较未诱导细胞变化不一,其中经2×10-3μg/μL的蜕皮激素诱导后增幅最明显,最高增幅可达10倍左右,表明受蜕皮激素诱导家蚕后CYP306, CYP339基因的上调表达与其基因启动子转录活性的升高有一定的关系。本研究为探索家蚕CYP306, CYP339过量表达的转录调控机理奠定了重要基础,但其具体功能和作用机制还待进一步研究。通过测定芸香苷对家蚕CYP 4家族基因的诱导表达差异来初步鉴定该基因家族与植物次生物质抗性的相关度。实验用芸香苷配制成梯度溶液(5×10-1 ng/μL, 5×10-2 ng/μL, 5×10-3 ng/μL)浸泡桑叶喂食家蚕。采用dual-spike-in qPCR法,检测在芸香苷诱导下家蚕中肠、脂肪体内CYP4M5和CYP4M9的基因转录水平。结果表明,在5×10-2 ng/μL芸香苷诱导下,脂肪体中CYP4M5, CYP4M9的转录水平在添食2 h时达到最高,分别为1 282.3, 39.382,与对照相比上升了21 336倍, 201倍;在中肠中CYP4M5, CYP4M9的转录水平分别在24 h, 48 h达到最高,上升了10 896倍, 1 816倍。在5×10-1 ng/μL诱导下转录水平变化没有5×10-2ng/μL诱导的明显,5×10-3 ng/μL下转录水平几乎没有变化。说明CYP 4家族基因的转录水平与芸香苷诱导的浓度和时间有关,在低浓度下诱导变化不明显,过高的浓度又会抑制基因的表达。实验结果证明,已知的家蚕CYP 4家族基因与植物次生物质的代谢抗性密切相关。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 引言
• 第一章 文献综述
• 1 细胞色素P450 酶系与细胞色素P450
• 1.1 细胞色素P450 酶系
• 1.2 细胞色素P450
• 2 昆虫细胞色素P450 及其研究进展
• 2.1 昆虫P450 的特点
• 2.2 昆虫P450 基因的调控
• 2.3 研究进展
• 3 家蚕P450 基因及其研究进展
• 3.1 参与内源物质代谢
• 3.2 参与外源物质代谢
• 3.3 研究进展
• 4 实时荧光定量PCR 技术
• 4.1 实时荧光定量PCR 原理
• 4.2 实时荧光定量PCR 的方法
• 5 启动子及其研究进展
• 5.1 概述
• 5.2 启动子的特点
• 5.3 启动子的研究
• 5.4 昆虫启动子研究进展
• 第二章 蜕皮激素诱导下家蚕CYP3 基因家族的表达变化
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 核酸的提取
• 1.3 cDNA 第一链的合成
• 1.4 引物的设计与合成
• 1.5 Real-time PCR
• 1.6 标准曲线制作
• 1.7 数据统计与分析
• 2 结果与分析
• 2.1 蜕皮激素诱导后CYP 3 基因家族成员在中肠中的转录水平
• 2.2 蜕皮激素诱导后CYP3 基因家族在脂肪体中的转录水平
• 2.3 在脂肪体中CYP3 基因家族部分基因在蜕皮激素诱导下和正常情况下的转录水平比较
• 3 讨论
• 第三章 CYP306、CYP339 基因启动子的活性分析
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料与试剂
• 2.2 CYP306、CYP339 基因启动子的克隆
• 2.3 荧光素酶报告质粒的构建
• 2.4 真核细胞转染实验
• 2.5 细胞抽提物制备和双荧光素酶活性检测
• 3 结果与分析
• 3.1 CYP306、CYP339 基因启动子的PCR 扩增
• 3.2 CYP306、CYP339 基因启动子报告基因的构建
• 3.3 家蚕CYP306, CYP339 基因启动子在BmN 细胞中的转录活性
• 3.4 诱导物对CYP306, CYP339 基因启动子转录的影响
• 4 讨论
• 第四章 家蚕P450 4 家族基因对植物次生物质的抗性研究
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 试剂和药品
• 3 主要方法
• 3.1 核酸的提取
• 3.2 cDNA 第一链的合成
• 3.3 引物的设计与合成
• 3.4 Real-time PCR
• 3.5 标准曲线制作
• 3.6 数据统计与分析
• 4 结果与分析
• 4.1 在脂肪体中CYP4M5 和CYP4M9 基因在芸香苷诱导下和正常情况下的转录水平比较
• 4.2 在中肠中CYP4M5 和CYP4M9 基因在芸香苷诱导下和正常情况下的转录水平比较
• 5 讨论
• 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的论文
• 致谢