逆转录病毒介导的分泌性人核糖核酸酶抑制因子对小鼠黑色素瘤基因治疗的研究

论文摘要

核糖核酸酶抑制因子（Ribonuclease Inhibitor, RI）是一种胞浆内酸性糖蛋白,分子量约为 50KDa。RI 是核糖核酸酶 A（RibonucleaseA, RNase A）的抑制剂,可以有效地抑制其对 RNA 的水解作用。RNaseA与血管生成因子（Angiogenin,Ang）的氨基酸有着高度保守的同源顺序。Ang 是由肿瘤细胞和正常细胞分泌的分子量为 14.4kDa 的蛋白质,属于 RNaseA 超家族的一员,在组织和细胞中的分布十分广泛。培养的结肠癌细胞、肝癌细胞中可检测到 Ang 的存在。在胃腺癌、结肠腺癌、乳腺癌、子宫内膜癌组织中也有表达。Ang 还存在于正常组织细胞中,如血浆、肾细胞、上皮细胞、血管平滑肌细胞、血管上皮细胞、成纤维细胞等。Ang 的广泛性,提示其在体内可能受到严格的调控。其在体内和体外均具有强烈的诱发血管生成的活性。RI 通过与 RNaseA(ki=4.0×10-14M)的紧密结合而抑制他们的活性。根据 cDNA 序列分析,Ang 与 RNase A 有 35%的同源性;但 Ang 与 RI 有更大的亲和力(ki=7.1×10-16M)。X 射线分析表明,Ang 与 RNase A 有着极其相似的立体结构,二者都可以与人胎盘 RI 紧密结合。由于 RI 可以与 Ang 形成紧密的非共价结合,从而可以抑制其促血管生成的活性。此外 RI 还可能通过抑制碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）的表达等途径抑制血管生成。 大量实验表明,新生血管的生成对于肿瘤的生长和转移是必须的;·2·并且外源性限制血管的生成可以明显地抑制肿瘤的生长,甚至可以使肿瘤消退。因此 Folkman 从其开创性的研究中提出假说认为,阻断肿瘤的血管形成就可以阻止肿瘤的生长。至今为止,已有很多的血管阻断剂被发现。但应用这些阻断剂一个明显的不足是需要高浓度的阻断剂才可以有效地抑制肿瘤的生长,而这些阻断剂又因为复杂的提取过程,在应用上受到限制。基因治疗可以在一定程度上解决这个问题。所谓基因治疗是指,用一定的方法将外源基因导入目的细胞中,使之在体内长期进行表达,从而达到治疗的目的。目前,基因治疗的导入系统可分为两类:病毒载体系统和非病毒载体系统。现在有相当多的基因治疗临床项目是采用前者中的逆转录病毒载体。本文所用的逆转录病毒载体 pLNCX 有来源于鼠莫氏白血病病毒和鼠莫氏肉瘤病毒的长末端重复序列（LTR）及巨细胞病毒即早启动子（PCMV）和一个新霉素筛选标记（neo）。该载体质粒一旦被转染入包装细胞系 PA317 即可被其表达的逆转录病毒外壳蛋白所包装,从而形成有感染力,却复制缺陷型的逆转录病毒颗粒。抗血管生成将是一种抑制肿瘤的生长和转移的有效方法。动物试验显示 RI 能抑制动物体内某些移植实体瘤的生长,给予荷瘤小鼠 RI后可以抑制乳腺癌实体瘤 Ca761,肉瘤 S180,肝癌实体瘤 H22,C6 大鼠神经胶质瘤等的生长。我们以前的实验也显示 RI 在肿瘤病人的血中活性下降,并且 RI mRNA在乳腺癌中比其在正常组织中显著降低。RI 由含有许多亮氨酸的重复顺序的多肽组成,含有这样重复顺序的一百多种蛋白质显示了广泛的功能,包括细胞周期调节、DNA 修复、对细胞外基质相互作用以及抑制酶活性等。RI 被认为是胚胎发育、创伤愈合及肿瘤发生中新血管形成的一种调节因子。RI 定位于染色体的11p15.5,与 ras 基因邻近,在肿瘤病人中经常存在染色体的 11p15.5部位的变异。RI 可能与细胞的生长和分化有关。因此,RI 可能还具有尚未知的生物学作用。但是,RI 在生理状态下是一种胞浆蛋白,这使得它和作为分泌性蛋白发挥功能的 Ang 的结合受到一定的限制而不能及时的起到对肿瘤的抑制作用。本研究将人核糖核酸酶抑制因子（hRI）的 N 端连上鼠免

论文目录

• 一、论文
• （一） 中文摘要
• （二） 英文摘要
• （三） 前言
• （四） 第一部分分泌性人核糖核酸酶抑制因子逆转录病毒载体的构建及其产毒细胞系的建立
• （五） 第二部分逆转录病毒介导的分泌性人核糖核酸酶抑制因子对小鼠B16黑色素瘤治疗作用的研究
• （六） 讨论
• （七） 结论
• （八） 参考文献
• 二、文献综述
• （一） 正文
• （二） 参考文献
• 三、致谢
• 四、附件