人血清、唾液和H1N1流感病毒中的蛋白糖基化分析

论文摘要

蛋白糖基化修饰是最重要、最普遍的蛋白质翻译后修饰之一。糖基化通过改变修饰蛋白的各种生物学特性、调节细胞间识别、调控、信号传导、免疫应答、细胞转化等而参与各种生物学过程。蛋白糖基化同样在流感病毒等微生物感染宿主过程中发挥重要作用,病毒蛋白糖基化影响病毒的宿主范围和毒力；蛋白糖基化程度及其糖链结构的异常变化常伴随于癌症及其他疾病的发生发展过程中,很多糖蛋白已用于人类相关疾病的诊断、分期和愈后评估。开发新的蛋白糖基化研究技术,并在糖组学水平开展各种生理病理条件下蛋白糖基化的改变分析研究,对于深入了解蛋白糖基化功能、寻找新的疾病相关生物标记物和探讨各种生理病理相关分子机制等都具有极其重要的意义。本实验中,第一部分研究内容：将磁性微粒与肼化学相结合,建立了一种简单快速地从生物样本中提取N-糖肽的新方法,并结合生物质谱检测方法,建立一套N-糖基化位点鉴定的新体系。通过对肼功能化磁性微粒制备方法的筛选及肼功能化磁粒提取N-糖肽的条件（封闭剂、磁粒用量、反应时间和温度等）的优化,肼功能化磁粒对N-糖蛋白的偶联容量和特异性均优于目前常用的酰肼树脂。通过对标准蛋白混合物中N-糖蛋白或N-糖肽的提取和N-糖基化位点的鉴定,证明了肼功能化磁粒提取N-糖肽新方法的可行性。第二部分研究内容：分别采用基于酰肼化学的N-糖蛋白提取、N-糖肽提取和唾液酸化N-糖肽提取三种提取方法,从健康志愿者血清和肝细胞癌患者血清中提取N-糖肽（已去糖基化）,并结合生物质谱鉴定N-糖蛋白及其糖基化位点。同时,联合糖蛋白的非糖基化多肽质谱数据,利用emPAI无标记定量方法对两种血清中的N-糖蛋白进行定量分析。从肝癌患者血清和健康志愿者血清中共鉴定到169种非冗余N-糖肽,103种N-糖蛋白,包含183个特异N-糖基化位点。其中发生末端唾液酸化的糖蛋白和糖肽分别占44.7%和48.0%,新鉴定到的N-糖肽和糖蛋白分别为15%的和17.7%。所鉴定道的血清N-糖蛋白主要是细胞外蛋白细胞蛋白、细胞器蛋白、膜蛋白和高分子复合物组分蛋白；主要参与刺激反应、生物学调控、细胞过程、多细胞有机体过程、免疫过程、代谢过程和信号等生物学过程；具有结合、酶活性调节和酶催化等分子功能。在两种血清中共同鉴定到的糖蛋白有76种,在盯癌患者血清中单独鉴定到12种,健康志愿者血清中单独鉴定到15种。另外,在肝癌患者血清中有9种N-糖蛋白含量明显增加,7种明显减少。这些差异糖蛋白主要在防御反应,细胞过程,生物过程、细胞过程和发展过程的调控等方面发挥作用。此外,实验结果表明,改进的N-糖蛋白提取方法具有可以使糖蛋白鉴定结果更准确,可以借助emPAI方法进行糖蛋白定量,可以鉴定到一些无法通过N-糖肽提取方法鉴定的N-糖蛋白,与N-糖肽提取方法具有很好的互补性等优点。第三部分研究内容：采用酰肼化学和亲水亲和两种糖肽提取方法,对不同性别儿童、成年、老年三个年龄段（共6组）健康志愿者全唾液中的N-糖蛋白及其糖基化位点进行了鉴定、比较和和综合性分析。从各年龄段混合唾液中共鉴定到156个非冗余N-糖肽,包含164个特异N-糖基化位点,代表85个N-糖蛋白：其中新鉴定到的N-糖蛋白和N-糖肽分别占18%和24%,17种N-糖蛋白首次在唾液中发现。唾液中41.2%的N-糖蛋白和35.2%的N-糖肽同样存在于健康人血清中。唾液N-糖蛋白中,分子量在10-100KD之间的占78%,等电点小于7的占80.2%,说明唾液N-糖蛋白主要是中低分子量且呈酸性的蛋白质。唾液N-糖蛋白主要是细胞外蛋白、细胞蛋白及细胞器蛋白；主要参与细胞过程、刺激反应、生物调节、代谢过程和免疫反应等生物学过程；具有结合、酶催化和酶活性调节等分子功能。唾液N-糖蛋白的种类随着年龄增长均具有增加趋势,且男性的增加速度大于女性。成年男性、女性唾液中N-糖蛋白种类差异较大,而老年男女性唾液中N-糖蛋白差异较小。另外,也找到了一些年龄和性别相关唾液N-糖蛋白。年龄增长过程中增加的唾液糖蛋白主要在免疫,生物过程,酶活性抑制调节,血管内皮生长因子生产和生物过程负调控,细胞死亡和程序性死亡等方面发挥作用。其中免疫相关唾液糖蛋白的增加普遍发生于人年龄增长过程中,这些糖蛋白主要在补体通路途径中发挥作用。通过与血清糖蛋白的比较发现,41.2%的人全唾液糖蛋白同样存在于健康人血清中。另外,实验结果表明,酰肼方法提取到的N-糖肽和N-糖蛋白数量和提取特异性都明显优于亲水亲和方法,但两种方法在糖蛋白和糖肽提取中依然具有一定的互补性。该研究为性别和年龄相关人唾液糖蛋白质组研究奠定基础,同时也为年龄和性别相关人类疾病的发病机理研究提供重要科学数据。第四部分研究内容：应用一系列生物信息学工具,对H1N1流感病毒演化过程中糖基化位点改变的方式、规律和作用进行了全面分析和深入探讨。通过对H1N1流感病毒中的2770条血凝素（HA）全长序列和3235条神经氨酸酶（NA）的潜在N-糖基化位点预测,糖基化位点的进化和保守性进行分析,蛋白3D结构同源建模和计算机模拟蛋白糖基化,发现不同宿主体内的H1N1流感病毒经历不同的蛋白糖基化变化过程；人H1N1流感病毒进化过程中有两种不同病毒蛋白糖基化改变模式,一种是病毒进化前期较高频率的糖基化位点数量的增加,另一种则是病毒进化后期较低频率的糖基化位点位置的变更。病毒蛋白糖基化变化的可能功能有：屏蔽HA和NA上的抗原性位点,保护NA免受宿主蛋白酶酶切,稳定HA三聚体和NA四聚体的四级结构,调节HA的受体结合活性和NA的神经氨酸酶活性以及调节两种活性的平衡。虽然本文中的一些结论和假设还需要进一步实验数据的支持,这些结果可对流感病毒的蛋白糖基化研究和病毒疫苗生产起到一定的指导作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1 糖蛋白质组学研究概述
• 1.1 糖蛋白定义及主要类型
• 1.2 蛋白糖基化特点及对分析方法的影响
• 1.3 蛋白质糖基化研究的内容和策略
• 2 糖蛋白质组研究技术
• 2.1 凝胶上糖蛋白研究技术
• 2.2 糖蛋白/糖肽的富集
• 2.3 糖蛋白/糖基化位点的鉴定
• 2.4 糖链结构的鉴定及含糖量的测定
• 3 人类相关糖蛋白质组研究进展
• 3.1 血清、血浆糖蛋白质组研究进展
• 3.2 尿糖蛋白质组研究进展
• 3.3 唾液糖蛋白质组研究进展
• 3.4 膜糖蛋白质组研究进展
• 3.5 疾病相关糖蛋白质组研究进展
• 4 流感病毒蛋白糖基化研究进展
• 5 糖蛋白质组学展望
• 本论文研究的目的和意义
• 第二章 肼功能化磁性微粒提取N-糖肽并鉴定N-糖基化位点方法的建立
• 1 引言
• 2 实验部分
• 2.1 试剂与材料
• 2.2 实验仪器
• 2.3 肼功能化磁性微粒的制备
• 2.4 肼功能化磁粒中肼基团密度的测定
• 2.5 肼功能化磁粒的封闭
• 2.6. N-糖蛋白的提取
• 2.7 N-糖肽的提取
• 2.8 偶联效率和提取效率的计算
• 2.9 SDS-PAGE
• 2.10 质谱分析
• 2.11 数据库检索和糖基化位点鉴定
• 3 实验结果
• 3.1 四种肼功能化磁粒制备方法的比较
• 3.2 封闭缓冲液的选择
• 3.3 糖蛋白提取条件的优化
• 3.4 N-糖蛋白的提取
• 3.5 N-糖肽的提取与鉴定
• 4 讨论
• 5 小结
• 第三章 肝癌患者血清中的糖蛋白差异分析
• 1 引言
• 2 实验部分
• 2.1 试剂与材料
• 2.2 实验仪器
• 2.3 健康志愿者血清和肝癌患者血清的采集
• 2.4 血清糖蛋白与酰肼树脂的偶联
• 2.5 树脂上糖蛋白的酶解
• 2.6 溶液中血清蛋白的酶解
• 2.7 血清蛋白酶解液中糖肽与酰肼树脂的偶联
• 2.8 血清蛋白酶解液中糖链末端唾液酸化N-糖肽与酰肼树脂的偶联
• 2.9 酰肼树脂上N-糖肽的释放
• 2.10 LC-MS/MS分析
• 2.11 质谱数据的数据库检索和糖基化位点鉴定
• 2.12 鉴定N-糖蛋白的GO分析
• 3 实验结果
• 3.1 三种方法提取糖蛋白和糖肽比较
• 3.2 与Uniprot数据库比对结果
• 3.3 人血清糖蛋白的GO分析
• 3.4 肝癌患者血清和健康志愿者血清中糖蛋白种类差异分析
• 3.5 肝癌患者血清和健康志愿者血清中糖蛋白的功能差异分析
• 4 讨论
• 5 小结
• 第四章 不同年龄和性别人唾液中糖蛋白的比较分析
• 1 引言
• 2 实验部分
• 2.1 试剂与材料
• 2.2 实验仪器
• 2.3 健康志愿者全唾液的采集
• 2.4 唾液蛋白定量和SDS-PAGE电泳验证
• 2.5 唾液蛋白的溶液内酶解
• 2.6 酰肼树脂提取唾液N-糖肽
• 2.7 亲水方法提取唾液N-糖肽
• 2.8 LC-MS/MS分析
• 2.9 质谱数据的数据库检索和糖基化位点鉴定
• 2.10 鉴定糖蛋白的生物信息学分析
• 3 实验结果
• 3.1 各年龄段混合唾液中的蛋白质含量和分布
• 3.2 两种N-糖肽提取方法的比较
• 3.3 人唾液糖蛋白的GO分析
• 3.4 与 Uniprot数据库比对结果
• 3.5 鉴定到的唾液N-糖蛋白和N-糖肽的分子量和等电点分布
• 3.6 不同性别和年龄段人唾液中糖蛋白种类差异分析
• 3.7 相同性别不同年龄段人唾液糖蛋白的功能差异分析
• 3.7 相同年龄段不同性别人唾液糖蛋白的功能差异分析
• 3.8 人唾液中糖蛋白相关免疫通路
• 3.9 人血和全唾液中糖蛋白异同
• 4 讨论
• 5 小结
• 第五章 甲型H1N1流感病毒进化过程中的蛋白糖基化位点变异分析
• 1 引言
• 2 实验部分
• 2.1 实验材料
• 2.2 潜在N-糖基化位点的预测和保守性分析
• 2.3 同源建模和蛋白糖基化的计算机模拟
• 3 实验结果
• 3.1 Sequon Finder软件介绍
• 3.2 人爆发性和流行性H1N1流感病毒中HA和NA上潜在糖基化位点的比较
• 3.3 人流行性H1N1流感病毒进化过程中HA和NA上潜在糖基化位点数量的改变
• 3.4 人流行性H1N1流感病毒中HA和NA上潜在糖基化位点的保守性
• 3.5 同源建模和蛋白糖基化的计算机模拟
• 3.6 人流行性H1N1流感病毒进化过程中HA和NA上潜在糖基化位点位置的改变
• 3.7 人感染的猪H1N1流感病毒中HA和NA上潜在糖基化位点的模式
• 3.8 其他源性H1N1流感病毒进化过程中HA和NA上潜在糖基化位点的模式
• 4 讨论
• 4.1 分析方法的选择
• 4.2 人流行性H1N1流感病毒进化过程中蛋白糖基化的两种改变方式
• 4.3 人流行性H1N1流感病毒进化过程中蛋白糖基化的保守性和功能
• 4.4 蛋白糖基化位点改变在人流行性H1 N1流感病毒进化过程中的可能生物学功能
• 4.5 不同宿主中H1N1流感病毒中具有不同的糖基化位点进化模式
• 4.6 蛋白糖基化对流感病毒疫苗生产和药物设计的影响
• 5 小结
• 全文总结
• 参考文献
• 攻读博士期间的研究成果
• 致谢
• 作者简介