重组人粒细胞集落刺激因子的克隆、表达、纯化和PEG单修饰以及修饰前后的体内外生物学活性

论文摘要

目的:构建、表达pJGW-2-G-CSF表达载体,表达产物G-CSF经纯化后经PEG20k化学修饰,纯化得到修饰产物PEG-G-CSF,测定修饰前后G-CSF体外和小鼠体内的生物学活性。方法:酶切回收目的G-CSF DNA片段,将目的基因插入pJGW-2中构建成表达载体,转化大肠杆菌,挑取单菌落提取质粒进行PCR鉴定。鉴定后的阳性克隆温度诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和免疫学鉴定正确后,纯化包涵体,进行蛋白的变性、复性,复性后蛋白再经离子交换和分子筛进行纯化,得到纯品G-CSF,薄层扫描仪扫描凝胶以检测纯度。用PEG20k单修饰G-CSF,修饰产物PEG-G-CSF经离子交换和分子筛进行纯化,得到纯品PEG-G-CSF ,HPLC检测纯度。测定修饰前后的G-CSF体内外生物学活性。结果:经PCR鉴定证明所构建质粒为pJGW-2-G-CSF重组质粒,SDS-PAGE证实表达后所获得的融合蛋白分子量为19KD,表达量约占菌体总蛋白的40%,以不溶的包涵体形式存在。Western blot印迹表明目的蛋白具有人G-CSF的抗原性。纯化后产物SDS-PAGE电泳后经凝胶扫描仪扫描纯度为95%。在G-CSF∶PEG（mg/mg）为1∶6,pH6.0,反应时间为48h,室温下进行修饰反应时,G-CSF的单PEG修饰度最高, PEG-G-CSF达到45%左右。经纯化后获得纯度大于95%的PEG-G-CSF。修饰前G-CSF的体外生物学活性为1.0×108u/mg,修饰后G-CSF的为2.0×107u/mg。经修饰,G-CSF的体外生物学活性下降,但在小鼠体内的作用时间延长,同时显著增强了G-CSF在小鼠体内血浆中白细胞的增殖。结论:成功构建pJGW-2-G-CSF表达载体,在大肠杆菌中获得表达,获得包涵体复性后的纯化蛋白。建立了PEG-G-CSF的生产工艺;纯化的G-CSF经PEG单修饰并纯化得到纯度大于95%的PEG-G-CSF。初步证明,经PEG单修饰后,G-CSF的体外生物学活性下降,但在小鼠体内的作用时间延长,显著增强了G-CSF在小鼠体内的活性。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 1. G-CSF 的基因结构和基因定位
• 2. G-CSF 的蛋白质结构
• 3. G-CSF 的生物学活性
• 4. G-CSF 的临床应用
• 5. G-CSF 的改造
• 6. 蛋白质聚乙二醇化的原理和方法
• 7. 聚乙二醇化蛋白的生物学特性
• 8. 聚乙二醇化技术的研究进展
• 9. 聚乙二醇化 G-CSF 的研究与应用概况
• 10. 本实验研究内容与意义
• 1. 材料与方法
• 1.1 常用仪器
• 1.2 材料
• 1.3 主要溶液的配制
• 1.4 方法
• 2.结果
• 2.1 重组质粒 pJGW-2-G-CSF 的 PCR 鉴定
• 2.2 G-CSF 的表达和纯化
• 2.3 G-CSF 的 Western blot
• 2.4 修饰反应条件的优化
• 2.5 修饰产物的纯化
• 2.6 G-CSF 修饰前后的体外生物学活性测定
• 2.7 G-CSF 修饰前后在小鼠体内作用时间的比较
• 2.8 G-CSF 修饰前后在小鼠体内活性的比较
• 3. 讨论
• 3.1 G-CSF 的克隆、表达和纯化
• 3.2 G-CSF 的 PEG 修饰
• 3.3 G-CSF 的体内外生物学活性
• 4. 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 综述
• 参考文献