木瓜属种质资源的RAPD、AFLP亲缘关系鉴定及遗传多样性分析

论文摘要

木瓜属（Chaenomeles）起源于我国,具有丰富的资源和品种类型和良好的应用前景。目前,关于木瓜属种质资源遗传多样性及亲缘关系的研究还未见报道。本研究利用RAPD（Random amplified polymorphic DNA ,随机扩增的多态性DNA）标记技术,对我国木瓜属12个品种,即‘猩红与金黄’C.×superba‘Crimson and Gold’、‘长寿乐’C.×superba‘Changshoule’、‘绿宝石’C.×superba‘LüBaoshi’、‘多彩’C. speciosa‘Toyo Nishiki’、‘红星’C. speciosa‘Hongxing’、‘大富贵’C.×superba‘Da Fugui’、‘红宝石’C.×superba‘Hong Baoshi’、‘复长寿’C.×superba‘Fu Changshou’、‘单白’C. japonica‘Danbai’、‘碧雪’C.×superba‘Bixue’、‘罗扶’C. cathayensis‘Luofu’、‘长俊’C. cathayensis‘Changjun’进行基因组多态性分析,筛选了5个随机引物;利用AFLP（Amplified fragment length polymorphism扩增片段长度多态性）标记技术我国木瓜属（Chaenomeles）的29个品种即‘猩红与金黄’C.×superba‘Crimson and Gold’、‘长寿乐’C.×superba‘Changshoule’、‘报春’C. speciosa‘Baochun’、‘绿宝石’C.×superba‘LüBaoshi’、‘多彩’C. speciosa‘Toyo Nishiki’、‘紫衣’C.×superba‘Ziyi’、‘凤凰木’C. speciosa‘Fenhuang Mu’、‘红星’C. speciosa‘Hongxing’、‘大富贵’C.×superba‘Da Fugui’、‘红宝石’C.×superba‘Hong Baoshi’、‘复长寿’C.×superba‘Fu Changshou’、‘单白’C. japonica‘Danbai’、‘碧雪’C.×superba‘Bixue’、‘单粉’C. japonica‘Dan Fen’、‘日落’C. japonica‘Riluo’、‘红霞’C. cathayensis‘Hongxia’、‘醉杨妃’C. cathayensis‘Zui Yangfei’、‘罗扶’C. cathayensis‘Luofu’、‘长俊’C. cathayensis‘Changjun’、‘一品香’C. cathayensis‘Yipin Xiang’、‘夕照’C. speciosa‘Xizhao’、‘沂红’C.×superba‘Yi Hong’、‘矮红’C. japonica‘Pygmaeus’、‘粉蝶’C.×superba‘Fendie’、‘红舞’C.×superba‘Hongwu’、‘日本红’C. japonica‘Rubra’、‘沂橙’C.×superba‘Yi Cheng’、‘骄阳’C.×superba‘Jiaoyang’、‘四季红’C. japonica‘Siji Hong’进行基因组多态性分析,从64对引物中筛选了8对随机引物。在NTSYS程序中,统计这些扩增产物用来计算遗传相似系数和遗传距离,建立UMPGA （不加权算术平均法）聚类分析图。从分子水平上研究木瓜属中部分种及品种的亲缘关系和遗传多样性。主要结论如下:（1）通过对常规CTAB法和改良CTAB法两种DNA提取方法对木瓜属品种幼叶的提取效果进行比较研究,确定改良CTAB法较为适合木瓜属品种幼叶基因组DNA的提取,所提的DNA适宜RAPD和AFLP分析。（2）用RAPD-PCR技术对12木瓜属品种进行基因组DNA多态性分析,5个随机引物扩增出313个DNA片段,其中288条谱带表现多态性,多态性检测率为92.01%,表明受试木瓜属品种之间富含遗传多态性带。将扩增图谱利用UPGMA方法构建遗传聚类树状图,分析品种间遗传关系。相似系数0.66将12个木瓜属品种划分为4个品种群,不同相似系数的聚类群划分与花色之间并非完全未有相关性。来源相同花色一致的木瓜属品种之间亲缘关系相对较近,但种源来源对木瓜属品种的亲缘关系的影响比花色更为突出。（3）采用AFLP标记技术对29个木瓜属品种进行研究。8对AFLP引物组合（E-AAG + M-CAA、E-ACA + M-CAA、E-AAG + M-CAC、E-AAG + M-CAG、E-AAG + M-CAT、E-AAG + M-CTG、E-ACA + M-CTT和E-ACG + M-CTT）总计获得1095个位点,其中多态性位点1035个,平均多态率为94.52%。引物组合E-AAG/M-CAT的扩增带数、多态性带数目、多态性比率和标记指数都较高。8对引物组合可以成功地鉴定29个品种,与RAPD结果基本吻合。聚类结果表明,29份供试材料在相似系数为0.61处可划分为四个品种群:贴梗海棠品种群,木瓜海棠品种群、日本海棠品种群和傲大品种群。四个种内各个品种均聚在一起,然后木瓜海棠品种群单独聚在一起,另外其他三个品种群聚在一起,表明同一种的品种间基因型相似系数较高,而木瓜海棠与其它三个品种群的亲缘关系较远。接着日本海棠与其它两个品种群分开,表明日本海棠与另两个品种群亲缘关系较远,而另外两个品种群即贴梗海棠品种群与傲大品种群亲缘关系最近。（4）比较了RAPD和AFLP标记对主要木瓜属样品遗传多样性的研究结果,AFLP标记是检测遗传多样性能力较优、获得多态性效率较高的分子标记。本实验的研究结果表明,RAPD和AFLP技术运用到木瓜属品种的分类上是可靠的,但并不排斥其它分类方法,而应尽量与形态特征相结合,使木瓜属品种的分类更科学、更合理、更准确。总的来说,两种标记的分析结果基本一致,在木瓜属品种鉴别、遗传多样性和亲缘关系分析上稳定、有效。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 木瓜属资源的研究概况
• 1.1.1 木瓜属的分类学研究
• 1.1.2 木瓜属的品种分类研究
• 1.2 分子标记的主要类型
• 1.2.1 形态标记
• 1.2.2 细胞学标记
• 1.2.3 生化标记
• 1.2.4 DNA 分子标记
• 1.2.4.1 RFLP 标记
• 1.2.4.2 染色体原位杂交
• 1.2.4.3 RAPD 标记
• 1.2.4.4 SSR 标记
• 1.2.4.5 ISSR 标记
• 1.2.4.6 AFLP 标记
• 1.2.4.7 EST-SSR 标记
• 1.2.4.8 SCAR 标记
• 1.2.4.9 SNP 标记
• 1.3 国内外园林植物种质资源研究现状
• 1.3.1 RAPD 技术在我国观赏植物中的用应
• 1.3.1.1 系统发育、演化及分类
• 1.3.1.2 亲缘关系鉴定
• 1.3.1.3 品种分类和种质资源遗传多样性方面的应用
• 1.3.1.4 RAPD 指纹图谱和目标性状基因标记应用
• 1.3.1.5 RAPD 技术的局限性及应用前景
• 1.3.2 AFLP 分子标记在我国观赏植物中的用应
• 1.3.2.1 遗传多样性和亲缘关系分析
• 1.3.2.2 遗传图谱的构建
• 1.3.2.3 基因定位和克隆
• 1.3.2.4 种质资源和品种的鉴定
• 1.3.2.5 辅助选择育种
• 1.4 木瓜属植物分类研究中存在的问题及本研究的意义
• 2 实验材料和方法
• 2.1 实验试剂与仪器
• 2.1.1 主要实验试剂
• 2.1.2 主要实验仪器
• 2.2 主要溶液的配制
• 2.3 植物总 DNA 的提取
• 2.3.1 木瓜属植物总DNA 的提取
• 2.3.2 DNA 样品纯度及浓度的检测
• 2.4 RAPD 分子标记研究
• 2.4.1 研究材料及取样
• 2.4.2 RAPD-PCR 扩增反应的初步体系及程序
• 2.4.3 RAPD-PCR 扩增反应的优化
• 2.4.4 RAPD-PC 扩增产物电泳
• 2.5 AFLP 分子标记研究
• 2.5.1 研究的品种及取样
• 2.5.2 模板DNA 的酶切与连接
• 2.5.3 AFLP 的预扩增反应
• 2.5.3.1 预扩增反应体系
• 2.5.3.2 预扩增反应条件
• 2.5.3.3 预扩增引物
• 2.5.4 AFLP 的选择性扩增反应
• 2.5.4.1 选择性扩增体系
• 2.5.4.2 选择性扩增反应条件
• 2.5.5 AFLP-PCR 的聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.5.5.1 玻璃板处理
• 2.5.5.2 制胶
• 2.5.5.3 电泳
• 2.5.5.4 银染
• 2.5.6 AFLP 反应的引物筛选
• 2.6 数据分析
• 2.6.1 应用软件提取数据并分析
• 2.6.2 遗传相似系数
• 2.6.3 多态性计算
• 2.6.4 聚类分析
• 3 结果与分析
• 3.1 木瓜属植物基因组 DNA 的提取方法
• 3.1.1 木瓜属植物基因组DNA 的提取方法的改进
• 3.1.2 木瓜属DNA 的提取及纯度
• 3.2 RAPD 分子标记的亲缘关系鉴定和遗传多样性分析
• 3.2.1 RAPD 反应体系的建立
• 3.2.1.1 RAPD 反应体系优化
• 3.2.1.2 RAPD 方法扩增程序的优化
• 3.2.1.3 引物筛选
• 3.2.1.4 扩增结果
• 3.2.2 影响RAPD 反应体系稳定性的因素
• 3.2.3 利用RAPD 标记进行遗传多样性及亲缘关系的分析
• 3.2.3.1 基因间的相似系数
• 3.2.3.2 木瓜属DNA 的多态性分析
• 3.2.3.3 木瓜属品种 UPGMA 的聚类分析
• 3.2.3.4 木瓜属品种间亲缘关系分析
• 3.3 AFLP 分子标记的亲缘关系鉴定和遗传多样性分析
• 3.3.1 AFLP 反应体系的优化与建立
• 3.3.1.1 基因组 DNA 的酶切及人工接头的连接
• 3.3.1.2 预扩增
• 3.3.1.3 选择性扩增
• 3.3.1.4 电泳及银染
• 3.3.2 影响 AFLP 反应稳定性的因素
• 3.3.2.1 限制性核酸内切酶的选择和组合
• 3.3.2.2 引物设计
• 3.3.2.3 PCR 扩增
• 3.3.2.4 PCR 产物检测
• 3.3.3 利用 AFLP 标记进行遗传多样性及亲缘关系的分析
• 3.3.3.1 基因间的相似系数
• 3.3.3.2 木瓜属AFLP的多态性分析
• 3.3.3.3 木瓜属品种的 UPGMA 的聚类分析
• 3.3.3.4 木瓜属品种间亲缘关系分析
• 4 讨论
• 4.1 RAPD 和 AFLP 标记的多态性带的检出率及提高途径
• 4.1.1 RAPD 多态性带的检出率及提高途径
• 4.1.2 AFLP 标记多态性带检出率及提高途径
• 4.2 RAPD 和AFLP 标记的综合比较
• 4.2.1 RAPD 和AFLP 标记检测多样性的比较
• 4.2.2 RAPD 和 AFLP 标记聚类结果的比较
• 4.2.3 木瓜属种质资源研究中标记的选择
• 4.3 木瓜属种质资源的遗传多样性及亲缘关系探讨
• 4.4 木瓜属种质资源的保存与利用
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文目录