厚荚相思离体培养及农杆菌介导遗传转化技术的研究

论文摘要

本论文研究主要从继代增殖、愈伤组织的诱导和分化和无菌苗的生根壮苗及移栽三个方面对厚荚相思的离体培养体系进行研究，建立起较好的厚荚相思离体再生体系；从浸染时间、预培养时间和共培养时间对厚荚相思农杆菌介导遗传转化的影响进行了的研究，初步建立了厚荚相思的农杆菌介导遗传转化体系，为今后的厚荚相思离体培养与遗传转化研究提供重要的参考依据。试验结果表明：1、单独使用6-BA或KT对无菌苗的增殖效果不好，改良MS+6-BA0.5mg·L-1+KT1.0mg·L-1为适宜的继代增殖培养基，它能够使无菌苗在以较高的倍数增殖的同时保持旺盛的生长势，无菌苗的增殖倍数达3.4倍。2、2，4-D能有效地对厚荚相思不同的外植体部位诱导出愈伤组织，最高诱导率达100％；但诱导出的愈伤组织不能诱导分化形成不定芽。3、6-BA能有效地对厚荚相思不同的外植体部位诱导出愈伤组织，也能直接在外植体上诱导分化出不定芽。最适宜的不定芽诱导培养基为改良MS+6-BA2.5mg·L-1，不定芽的分化率最高，不同的外植体部位的分化率不同。最高的分化率为羽状复叶在此培养基上的直接分化，分化率为55.86％。4、NAA、IAA、IBA和ABT对厚荚相思无菌苗的生根均有较好的促进作用，MET不适合用于厚荚相思无菌苗的生根诱导。5、以不同的激素种类及其组合诱导生根所得组培生根苗的移栽成活率不同。以ABT0.5-2.0mg·L-1+MET0.5mg·L-1诱导生根的组培苗，在黄泥基质进行移栽的成活率最高，成活率达86.39％。6、不同的移栽基质对生根苗的移栽成活率有不同的影响。以黄泥：育苗介质（1∶1）进行移栽时移栽苗的成活率较高，成活率为84.36％。7、厚荚相思外植体对Km的有较高的基础抗性，抗性浓度为100～125mg·L-1。8、头孢噻肟钠浓度为300mg·L-1时可以完全抑制农杆菌At05、At06和A208SE的生长，但外植体保持较高的分化率。9、不同的菌株、菌液浓度、浸染时间、预培养和共培养对厚荚相思遗传转化GUS基因瞬时表达有不同的影响。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 1. 厚荚相思简介
• 2. 国内对木本植物器官离体培养的研究现状
• 3. 厚荚相思离体培养体系建立的现状和意义
• 4. 农杆菌转化系统的特点及其发展
• 5. 农杆菌介导法在我国主要经济林木中转化的进展。
• 6. 厚荚相思遗传转化体系建立的现状和发展意义
• 7. 本研究工作的目的和意义
• 第一章 材料与方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 质粒和菌株
• 1.3 培养基
• 1.3.1 植物材料培养基
• 1.3.2 农杆菌培养基
• 1.4 培养条件
• 1.4.1 植物材料培养条件
• 1.4.2 农杆菌培养条件
• 1.5 GUS染色液的配制
• 1.6 厚荚相思的离体培养
• 1.6.1 无菌苗继代增殖的试验设计
• 1.6.2 愈伤组织诱导的试验设计
• 1.6.3 愈伤组织分化的试验设计
• 1.6.4 无菌生根壮苗的试验设计
• 1.6.5 组培生根苗移栽的试验设计
• 1.7 厚荚相思农杆菌遗传转化的研究
• 1.7.1 农杆菌的准备
• 1.7.2 厚荚相思农杆菌介导遗传转化
• 1.7.3 卡那霉素选择压的确定
• 1.7.4 头孢噻肟钠浓度的筛选
• 1.7.5 筛选培养
• 1.7.6 含GUS基因组织的化学检测
• 1.8 试验结果观测与统计方法
• 第二章 结果与分析
• 2.1 厚荚相思无菌苗继代增殖的影响因素
• 2.1.1 单一使用6-BA或KT对厚荚相思无菌苗继代增殖的影响
• 2.1.2 不同浓度6-BA和KT互作对厚荚相思无菌苗继代增殖的影响
• 2.2 厚荚相思愈伤组织诱导的影响因素
• 2.2.1 不同浓度2,4-D、BA、KT对厚荚相思羽状复叶愈伤组织诱导的影响
• 2.2.2 不同浓度2,4-D、BA、KT对厚荚相思叶状柄愈伤组织诱导的影响
• 2.2.3 不同浓度2,4-D、BA、KT对厚荚相思茎段愈伤组织诱导的影响
• 2.3 不同激素诱导的愈伤组织的分化
• 2.4 厚荚相思生根的影响因素
• 2.4.1 单一激素种类及浓度对厚荚相思生根壮苗的影响
• 2.4.2 两种不同激素配合使用对厚荚相思生根壮苗的影响
• 2.4.3 三种不同激素配合使用对厚荚相思生根壮苗的影响
• 2.5 厚荚相思级培苗移栽及影响移栽成活的因素
• 2.5.1 单一不同激素生根处理对生根苗移栽成活率的影响
• 2.5.2 两种不同激素配组生根处理对生根苗移栽成活率的影响
• 2.5.3 三种不同激素配组生根处理对生根苗移栽成活率的影响
• 2.5.4 不同基质处理对组培苗移栽苗成活率的影响
• 2.6 厚荚相思农杆菌介导遗传转化的研究
• 2.6.1 不同浸染时间对厚荚相思农杆菌介导遗传转化GUS基因表达的影响
• 2.6.2 不同菌液浓度对厚荚相思农杆菌介导遗传转化GUS基因表达的影响
• 2.6.3 不同预培养时间对厚荚相思农杆菌介导遗传转化GUS基因表达的影响
• 2.6.4 不同共培养时间对厚荚相思农杆菌介导遗传转化GUS基因表达的影响
• 2.7 厚荚相思不同部位外植体部位对卡那霉素的敏感性
• 2.8 头孢噻肟浓度的筛选
• 2.9 筛选培养
• 第三章 讨论
• 3.1 外源激素对无菌苗继代增殖的影响
• 3.2 愈伤组织诱导和分化试验
• 3.3 激素对无菌苗生根诱导的影响
• 3.4 组培生根苗移栽成活的影响因素
• 3.5 厚荚相思遗传转化的影响因素
• 3.5.1 遗传转化途径和转化受体的选择
• 3.5.2 选择培养的选择压和选择方法
• 3.5.3 菌液浓度和浸染时间对遗传转化的影响
• 3.5.4 预培养对遗传转化的影响
• 3.5.5 共培养对遗传转化的影响
• 3.5.6 GUS基因瞬时表达检测及GUS基因的稳定表达
• 3.6 结束语
• 参考文献
• 附录一
• 附录二
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表论文情况