梓醇对D-半乳糖衰老小鼠的神经保护作用研究

论文摘要

梓醇是玄参科植物地黄（Rehmannia glutinosa Libosch）的主要成分,有保肝泻下,抗炎止痛,降血糖的功效。本实验室的前期研究证实:在细胞和动物模型上梓醇具有神经保护活性。然而梓醇是一种环烯醚萜类化合物,化学性质不稳定,分离工艺繁琐,来源有限,因此对现有工艺进行优化,对于梓醇的药理活性研究及产品开发具有现实意义。本研究旨在优化地黄中梓醇的提取纯化工艺,重点探讨梓醇在D-半乳糖致衰老小鼠模型中的神经保护作用及机制,主要研究内容与结果如下:首先,将微波辅助提取与大孔吸附树脂柱层析技术相结合,对梓醇工艺进行了优化。以高效液相色谱法为检测手段,考察冷浸、超声波辅助提取、微波辅助提取、热回流提取、索氏提取五种方法对梓醇提取率的影响。达到最大提取率时,微波辅助提取用时最短（4 min）,说明微波辅助提取方法在提取效率上优于其它方法,综合评价选用微波辅助提取法进行梓醇的提取;考察九种不同极性大孔吸附树脂对梓醇的吸附性能,结果表明,D101树脂对梓醇的吸附量较大（76.1 mg/g干树脂）,且对梓醇的解析率较高（92.1%）。该树脂对梓醇的吸附等温线符合Langmuir和Freundlich公式,为单分子层吸附,适于地黄醇提取液中梓醇的纯化。利用D101树脂层析柱,上样量为5 BV的地黄浓缩液（2 mg/ml）,以水和不同浓度的乙醇洗脱。收集含梓醇的5%乙醇洗脱液,浓缩干燥后,得到梓醇含量大于50%的褐色粉末,将其进行硅胶柱层析,氯仿:甲醇（8∶2）梯度洗脱得到梓醇单体,纯度达90%以上,得率为600 mg/kg药材。其次,建立皮下注射D-半乳糖致衰老小鼠模型,研究梓醇的神经保护作用及机制。（1）利用旷场、跳台和Morris水迷宫,考察梓醇对D-半乳糖衰老模型小鼠认知能力的影响,发现D-半乳糖致衰老小鼠的自主活动和探究能力,被动学习记忆和空间认知能力下降,应用梓醇治疗两周后,明显改善衰老小鼠的学习记忆能力。病理切片苏木素-伊红（HE）染色发现D-半乳糖衰老小鼠神经元细胞稀疏,细胞核固缩;生化方法检测到大脑皮层和海马内胆碱酯酶（AChE）活力上升,免疫组织化学方法发现基底前脑乙酰胆碱转移酶（ChAT）表达量减少,免疫印迹方法发现脑组织乙酰胆碱M受体（mAChR）表达量降低。应用梓醇后,不仅能够减轻D-半乳糖所致的小鼠大脑病理损伤,而且通过抑制AChE的活力,提高ChAT和mAChR表达来保护乙酰胆碱系统,进而维持神经递质乙酰胆碱（Ach）的含量,改善模型小鼠的学习记忆能力。（2）梓醇对D-半乳糖衰老模型小鼠体内抗氧化能力的研究表明:梓醇能显著提高大脑皮层、海马、肝和脾组织内超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、谷胱甘肽-S-转移酶（GSH-ST）活力,降低脂质过氧化产物丙二醛（MDA）含量。提示梓醇对衰老模型小鼠具有保护作用,其保护机制之一是提高机体内源性抗氧化酶活力,减轻脂质过氧化程度,保护机体免受氧化损伤。通过相关性分析,发现小鼠大脑皮层、海马内SOD和GSH-Px活力与小鼠水迷宫实验第五天逃避潜伏期呈负相关,MDA水平与第五天逃避潜伏期呈显著正相关,表明梓醇改善模型小鼠学习记忆能力可能与其提高大脑抗氧化能力有关。（3）考察梓醇对D-半乳糖衰老模型小鼠大脑能量代谢的影响,发现梓醇能够降低模型小鼠大脑皮层和海马组织乳酸脱氢酶（LDH）活力,提高肌酸激酶（CK）、Na+-K+-ATP和Ca2+-Mg2+-ATP酶活力;梓醇治疗组小鼠大脑皮层和海马线粒体呼吸链复合酶Ⅰ、Ⅱ/Ⅲ、Ⅳ活性明显高于D-半乳糖衰老模型小鼠,梓醇不仅抑制线粒体活性氧（ROS）的产生和线粒体膜电位（MMP）的降低,而且抑制衰老小鼠皮层和海马细胞的凋亡,提高抑凋亡蛋白Bcl-2的表达,抑制凋亡通路关键蛋白caspase-3的活性。这说明梓醇可通过提高线粒体呼吸链复合酶的活性,抑制线粒体ROS的产生,阻止MMP的丧失,上调Bcl-2蛋白的表达及拮抗caspase-3的激活,从而保持线粒体功能的完整性,进而抑制氧化应激所致的细胞凋亡同时上调能量代谢相关酶的活力,保护脑组织能量代谢的平衡来发挥其抗衰老作用。总之,本研究表明梓醇为地黄中主要的抗衰老活性成份之一,有可能在延缓衰老和与衰老相关的神经退行性疾病的预防和治疗中发挥作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 1.文献综述
• 1.1 衰老机理研究进展
• 1.1.1 免疫衰退学说
• 1.1.2 神经内分泌学说
• 1.1.3 蛋白质合成差错累积学说
• 1.1.4 基因程序学说
• 1.1.5 DNA损伤修复学说
• 1.1.6 端粒学说
• 1.1.7 自由基学说
• 1.1.7.1 自由基的产生与清除
• 1.1.7.2 自由基对生物体的损伤
• 1.1.7.3 自由基、线粒体与衰老
• 1.1.7.4 自由基与细胞凋亡
• 1.1.7.5 自由基损伤与衰老相关疾病
• 1.2 衰老动物模型研究进展
• 1.2.1 自然衰老模型
• 1.2.2 臭氧损伤衰老模型
• 1.2.3 γ射线辐照衰老模型
• 1.2.4 去胸腺衰老模型
• 1.2.5 SAMP系小鼠快速衰老模型
• 1.2.6 记忆损毁衰老模型
• 1.2.6.1 中枢胆碱能系统与学习记忆
• 1.2.6.2 记忆障碍模型
• 1.2.7 D-半乳糖衰老模型
• 1.2.7.1 D-半乳糖体内代谢途径
• 1.2.7.2 D-半乳糖衰老模型的机制
• 1.2.7.3 D-半乳糖衰老模型的应用
• 1.3 地黄的研究概况
• 1.3.1 地黄的化学成分研究概况
• 1.3.2 地黄的抗衰老药理研究概况
• 1.3.2.1 抗氧化损伤作用
• 1.3.2.2 调节单胺类神经递质
• 1.3.2.3 调节免疫功能与延缓免疫器官衰老
• 1.3.2.4 调整内分泌
• 1.3.2.5 抑制细胞凋亡
• 1.3.2.6 促进神经营养因子表达
• 1.3.2.7 拮抗核酸损伤
• 1.3.3 地黄中梓醇的研究概况
• 1.3.3.1 梓醇的理化性质
• 1.3.3.2 梓醇的药理作用
• 1.3.3.3 梓醇分析测定方法
• 1.3.3.4 梓醇稳定性的考察
• 1.3.3.5 梓醇的提取分离现状
• 1.4 中药的提取分离技术
• 1.4.1 中药提取的影响因素
• 1.4.2 新技术在中药提取中的应用
• 1.4.3 大孔吸附树脂在中药分离纯化中的应用
• 1.5 本研究的选题依据与研究内容
• 1.5.1 选题依据
• 1.5.2 实验内容
• 2.地黄中梓醇的提取分离工艺优化
• 2.1 实验材料与设备
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 药材中梓醇含量的测定
• 2.2.2 不同提取溶剂对梓醇提取率的影响
• 2.2.3 不同料液比对梓醇提取率的影响
• 2.2.4 不同提取方式对梓醇提取率的影响
• 2.2.5 静态吸附解吸实验
• 2.2.6 吸附等温线实验
• 2.2.7 吸附动力学实验
• 2.2.8 动态吸附解吸实验
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 梓醇的分析方法
• 2.3.2 药材中梓醇的含量
• 2.3.3 不同溶剂对梓醇提取率的影响
• 2.3.4 料液比对梓醇提取率的影响
• 2.3.5 不同提取方式对梓醇提取率的影响
• 2.3.6 树脂的筛选
• 2.3.7 浓度对吸附的影响（吸附等温线）
• 2.3.8 吸附动力学过程
• 2.3.9 动态吸附和解吸
• 2.3.10 工艺流程图
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 3.梓醇对D-半乳糖致衰老小鼠学习记忆能力的影响
• 3.1 实验材料与设备
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验设备
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 实验动物
• 3.2.2 药物配制
• 3.2.3 动物分组和给药
• 3.2.4 行为学实验
• 3.2.5 脑组织处理及准备
• 3.2.6 组织蛋白测定
• 3.2.7 苏木素-伊红染色
• 3.2.8 海马CAl区存活细胞计数
• 3.2.9 乙酰胆碱酯酶的测定
• 3.2.10 免疫组织化学检测乙酰胆碱转移酶活性
• 3.2.11 Western blotting检测小鼠大脑乙酰胆碱受体表达
• 3.2.12 统计学方法
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 梓醇对D-半乳糖致衰老小鼠外观的影响
• 3.3.2 旷场实验
• 3.3.3 跳台实验
• 3.3.4 Morris水迷宫实验
• 3.3.5 梓醇对D-半乳糖致衰老小鼠大脑病理变化的影响
• 3.3.6 梓醇对D-半乳糖致衰老小鼠皮层和海马AChE的影响
• 3.3.7 梓醇对D-半乳糖致衰老小鼠基底前脑ChAT表达的影响
• 3.3.8 梓醇对D-半乳糖致衰老小鼠大脑mAChR表达的影响
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 4.梓醇对D-半乳糖致衰老小鼠氧化损伤的保护作用
• 4.1 实验材料与设备
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验设备
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 实验动物
• 4.2.2 药物配制
• 4.2.3 动物分组和给药物
• 4.2.4 组织处理及准备
• 4.2.5 脾重指数
• 4.2.6 组织蛋白测定
• 4.2.7 超氧化物歧化酶活力的测定
• 4.2.8 谷胱甘肽过氧化物酶活力的测定
• 4.2.9 谷胱甘肽S-转移酶活力的测定
• 4.2.10 谷胱甘肽含量测定
• 4.2.11 丙二醛含量测定
• 4.2.12 统计学方法
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 梓醇对D-半乳糖致衰老小鼠皮层抗氧化能力的影响
• 4.3.2 皮层SOD、GSH-PX活力和MDA含量与水迷宫逃避潜伏期相关性分析
• 4.3.3 梓醇对D-半乳糖致衰老小鼠海马抗氧化能力的影响
• 4.3.4 海马SOD、GSH-PX活力和MDA含量与水迷宫逃避潜伏期相关性分析
• 4.3.5 梓醇对D-半乳糖致衰老小鼠大脑皮层和海马GSH-ST的影响
• 4.3.6 梓醇对D-半乳糖致衰老小鼠脾重指数的影响
• 4.3.7 梓醇对D-半乳糖致衰老小鼠肝脏抗氧化能力的影响
• 4.3.8 梓醇对D-半乳糖致衰老小鼠脾脏抗氧化能力的影响
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 5.梓醇对D-半乳糖致衰老小鼠细胞凋亡的保护作用
• 5.1 实验材料与设备
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 实验设备
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 实验动物
• 5.2.2 药物配制
• 5.2.3 动物分组和给药
• 5.2.4 脑组织处理及准备
• 5.2.5 脑组织线粒体的提取
• 5.2.6 乳酸脱氢酶的测定
• 5.2.7 ATP酶活性的测定
• 5.2.8 肌酸激酶的测定
• 5.2.9 线粒体呼吸链复合体酶活性测定
• 5.2.10 活性氧的检测
• 5.2.11 线粒体膜电位的检测
• 5.2.12 流式细胞仪分析细胞凋亡比例
• 5.2.13 Bcl-2和Bax蛋白分析
• 5.2.14 Caspase-3活性分析
• 5.2.15 蛋白质含量的测定
• 5.2.16 统计学方法
• 5.3 实验结果
• 5.3.1 梓醇对D-半乳糖致衰老小鼠皮层和海马LDH的影响
• 5.3.2 梓醇对D-半乳糖致衰老小鼠大脑皮层ATPase的影响
• 5.3.3 梓醇对D-半乳糖致衰老小鼠大脑海马ATPase的影响
• 5.3.4 梓醇对D-半乳糖致衰老小鼠皮层和海马CK的影响
• 5.3.5 梓醇对皮层和海马线粒体呼吸链复合体酶的影响
• 5.3.6 梓醇对皮层和海马线粒体ROS产生的影响
• 5.3.7 梓醇对皮层和海马线粒体膜电位变化的影响
• 5.3.8 流式细胞仪检测皮层和海马细胞凋亡比例
• 5.3.9 梓醇对皮层和海马细胞凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达的影响
• 5.3.10 梓醇对皮层和海马细胞线粒体凋亡通路蛋白Caspase-3的影响
• 5.4 讨论
• 5.4.1 梓醇改善D-半乳糖致衰老小鼠皮层和海马能量代谢障碍
• 5.4.2 梓醇提高D-半乳糖致衰老小鼠大脑皮层和海马线粒体功能
• 5.4.3 梓醇保护D-半乳糖致衰老小鼠大脑皮层和海马细胞凋亡
• 5.4.4 梓醇对D-半乳糖致衰老小鼠神经保护作用的机制探讨
• 5.5 小结
• 结论与展望
• 结论
• 展望
• 创新点摘要
• 参考文献
• 附录A 缩略词表
• 攻读博士学位期间发表学术论文情况
• 致谢