RNAi体内外特异性抑制食管癌细胞肝素酶基因表达的研究

论文摘要

食管癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，具有发病率高、发病隐匿、易转移和死亡率高等特点。目前治疗方法主要有手术、化疗、放疗等，对晚期食管癌患者不能手术治疗，且放疗、化疗疗效也不能令人满意。所以寻求食管癌治疗的新途径为研究热点之一。RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种有效抑制肿瘤发生发展和浸润、转移的新的基因治疗方法。该方法是将双链RNA（double strand RNA，dsRNA）导入细胞内引起同源mRNA降解的一种细胞反应过程。dsRNA进入细胞后被特异性dsRNA核酸酶（Dicer）切割成多个21bp-25bp的短干扰RNA（short interfering RNAs，siRNAs），siRNAs与一些核酸酶结合形成RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC），由RISC介导同源mRNA的降解，属于转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS）的一种。可直接在体外大量合成，易于筛选有效序列，为构建RNAi重组载体奠定基础。自从1998年被发现以来，作为有力工具，RNAi技术已被用于大肠癌、肝癌、卵巢癌等多种人类肿瘤的研究，但应用其研究食管癌少见报道。乙酰肝素酶，又名肝素酶（heparanase，HPA）是一种能够降解硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS）的糖苷内切酶，HS是糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）家族中的一个成员，是一种线性多聚糖，几条HS链与核心蛋白共价结合组成硫酸乙酰肝素糖蛋白（heparan sulfate proteoglycans，HSPGs），HSPGs是一类广泛存在于细胞表面、细胞外基质（ECM）和基底膜（BM）中的糖蛋白，它与多种生物活性分子结合并相互作用，HPA对HSPGs的降解，改变了组织的完整性，并释放出生物活性分子，如碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factors，bFGF），血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等，从而产生一系列的生物学现象如妊娠、炎症反应、血管生成等，促进肿瘤的侵袭和转移。本研究应用RNAi技术体内外特异性抑制食管癌细胞HPA表达，并采用免疫组化、原位杂交等技术检测RNAi抑制后HPA蛋白及mRNA在食管癌EC9706细胞、裸鼠食管癌抑制瘤组织中的表达情况，为临床应用RNAi技术对食管癌进行基因治疗提供理论依据。材料和方法1．食管癌EC9706细胞的培养：食管癌EC9706细胞以10％胎牛血清培养液（含青、链霉素各100u／ml）在37℃、5％CO2条件下贴壁培养。2．dsRNA的体外合成和鉴定：首先合成DNA模板，3′端为T7启动子序列，可在体外和T7 RNA聚合酶结合转录出目的dsRNA。应用4％琼脂糖凝胶电泳，以定量模板DNA为参照，测定dsRNA的长度和浓度。3．转染：应用LipofectamineTM 2000脂质体将dsRNA转染各组EC9706细胞。4．HPA RNAi体外抑制实验：采用浓度为10μmol／L、15μmol／L、20μmol／L体外合成的HPA siRNA转染EC9706细胞24h、48h、72h，另设无关序列组及不转染组作为对照。5．HPA RNAi体内抑制实验：①先转染后成瘤：采用浓度为20μmol／L体外合成的siRNA转染EC9706细胞72h，另设无关序列组及不转染组。然后种植于裸鼠皮下构建裸鼠食管癌移植瘤动物模型；②先成瘤后转染：构建裸鼠食管癌移植瘤模型，待肿瘤长出1W后，依3μg／只／次腹腔注射siRNA及无关序列，连续3d，另1组仅注射PBS作空白对照，6．转染后检测：采用免疫组化、原位杂交等方法检测转染后的EC9706细胞及裸鼠食管癌移植瘤中HPA蛋白及mRNA表达情况。7．统计学处理：应用SPSS10.0统计软件进行统计学处理，资料用均数±标准差（（?）±S）表示；多组均数的比较用方差分析，方差不齐时先进行变量转换。显著性水准a=0.05。结果1．成功体外合成两条HPA siRNA，长度为21bp。2．免疫细胞化学结果：10μmol／L、15μmol／L、20μmol／L 3种不同浓度特异HPA siRNA转染食管癌EC9706细胞24h、48h、72h后，HPA蛋白表达量均较对照组有所降低，以20μmol／L转染72h的抑制效应最为明显，3种浓度两两相比，差异均无统计学意义（P＞0.05），每个时间段内随剂量增加siRNA抑制效应均增强，3种浓度两两相比，差异均有统计学意义（P＜0.05），无关序列对照组及不转染组（空白对照组）均未表现出对HPA蛋白表达的抑制效应。各实验组与无关序列对照组及空白对照组两两相比，差异均有统计学意义(P＜0.01=。3．原位杂交结果：10μmol／L、15μmol／L、20μmol／L三种不同浓度特异HPA siRNA转染食管癌EC9706细胞24h、48h、72h后，HPA mRNA表达量均较对照组有所降低，同样以20μmol／L转染72h的抑制效应最为明显，3者两两相比，差异均无统计学意义（P＞0.05），每个时间段内随剂量增加siRNA抑制效应均增强，3者两两相比，差异均有统计学意义（P＜0.05），无关序列组及不转染组均未表现出对HPA mRNA表达的抑制效应。各实验组与无关序列对照组及空白对照组两两相比，差异均有统计学意义（P＜0.01）。4．HPA siRNA体外转染食管癌EC9706细胞24h、48h、72h后，其对HPA蛋白表达的抑制效应和对HPA mRNA表达的抑制效应，呈正相关关系（P＜0.05）。5．裸鼠体内实验结果：①先转染后成瘤组：浓度为20μmol／LHPA siRNA可下调裸鼠食管癌移植瘤组织中HPA蛋白及mRNA的表达，与无关序列组及空白对照组相比，差异均有统计学意义（P＜0.05）；②先成瘤后转染组：浓度为20μmol／L HPA siRNA亦可下调裸鼠食管癌移植瘤组织中HPA蛋白及mRNA的表达，与无关序列组及PBS空白对照组相比，差异均有显著性（P＜0.05）。①中siRNA的抑制效应较②稍弱，但两者相比，差异均无统计学意义（P＜0.05）6．无论是先转染后成瘤组或是先成瘤后转染组，HPA RNAi对裸鼠食管癌移植瘤组织中HPA蛋白和对其mRNA表达影响呈正相关关系（P＜0.05，先转染后成瘤组r=6.87；先成瘤后转染组r=7.04）。结论1．应用体外转录系统可成功合成dsRNA。2．体外采用不同浓度的HPA siRNA转染EC9706细胞后，EC9706细胞中HPA蛋白及mRNA表达均受到一定程度的抑制，同时HPA dsRNA可有效体内抑制裸鼠食管癌移植瘤组织中HPA蛋白及mRNA表达，提示HPA siRNA可通过特异性抑制HPA mRNA表达从而抑制HPA蛋白表达，进而抑制食管癌或其它恶性肿瘤的浸润转移。3．先转染后成瘤组及先成瘤后转染组中，HPA siRNA均对裸鼠食管癌移植瘤组织中HPA蛋白及mRNA表达有抑制作用，表明体内应用RNAi技术沉默目的基因具有可行性。4．先成瘤后转染组HPA siRNA沉默HPA基因表达能力强于先转染后成瘤组，且前者更接近临床，此研究结果为临床应用RNAi技术治疗恶性肿瘤奠定了一定的理论基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 论文部分
• RNAi体内外特异性抑制食管癌肝素酶基因的研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 照片
• 参考文献
• 综述部分
• 肝素酶与肿瘤浸润转移关系的研究进展
• 参考文献
• 英文缩写词
• 在读期间发表的学术论文
• 致谢