论文摘要
花椰菜（Brassica oleracea Var.botrytis）是十字花科芸薹属中重要的蔬菜作物,不仅在我国的蔬菜生产中占有重要地位,在世界范围内也广泛种植。但是近年来,花椰菜的虫害十分严重,其中以鳞翅目的菜青虫（Pieris rapae）和小菜蛾（Plutella xylostella）为主。在我国,小菜蛾对花椰菜的危害呈明显上升趋势。常用的化学防治措施不仅污染环境,且害虫容易产生抗药性,因此,选育和应用抗虫品种,既经济有效又安全环保,是防治害虫最理想的方法。Bt cry1Ia杀虫晶体蛋白基因是由本课题组从苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）的野生菌株Btc008中克隆得到的一种具有很高杀虫活性的杀虫晶体蛋白（Insecticidal crystal proteins,ICPs）。它是一类特殊的cry1类基因,与生产中常用的cry1A类基因相似性较低。Cry1Ia蛋白有较强的杀虫活性和相对较广的杀虫谱,对亚洲玉米螟、小菜蛾等有很强的杀虫活性,其杀虫效果与CrylAb和CrylAc相当,但与CrylAb和CrylAc无交互抗性。本研究以具柄子叶和下胚轴为外植体,通过根癌农杆菌介导法将苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白基因Cry1Ia导人花椰菜中,并优化了转化体系,研究了不同因素对花椰菜转化效率的影响。试验结果表明:花椰菜的基因型与外植体对抗性芽的再生有显著影响,本试验中瑞士雪球的具柄子叶和下胚轴是比较理想的外植体;不同激素对花椰菜芽再生的影响较大,本试验中添加2mg/L的6-BA和0.05mg/L的NAA时不定芽的再生频率较高;生根培养基中添加0.1mg/L的IAA时,生根效果最好;另外,用农杆菌EHA105介导的转化,转化效率要高于LBA4404;在侵染液及共培养基中添加乙酰丁香酮,能提高花椰菜的转化频率;在培养基中添加银离子并没有促进芽的再生;使用10mg/L的卡那霉素筛选阳性植株,可有效筛选出转基因植株;使用300mg/L的羧苄青霉素能完全抑制住农杆菌的污染;同时对农杆菌的侵染时间进行了优化,结果表明以下胚轴8 min、具柄子叶15min为最佳。转化后的外植体在含有卡那霉素的培养基上诱导不定芽和诱导生根,共获得了42株抗性植株,经PCR检测,其中的18株呈阳性。进一步通过RT-PCR和Western blot检测,共有14株均呈阳性反应,检测结果初步说明cry1Ia基因已整合到花椰菜的基因组中并得到有效地表达。转基因植株用小菜蛾幼虫进行饲虫试验,结果表明昆虫幼虫的校正死亡率高达99.96%,同时,存活幼虫的生长发育也受到了明显抑制。