论文摘要
前言阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是发生在老年人的一种以进行性痴呆为临床特征的神经退行性疾病。AD的典型病理特征老年斑（senile plaque, SP）是由β-淀粉样蛋白（β-amyloid, Aβ）在脑内异常沉积而形成。Aβ在细胞内由β-淀粉样蛋白前体蛋白（amyloid precursor protein, APP）经β-和γ-分泌酶水解生成并排出至细胞外。另外,APP还可以被α-分泌酶在β-和γ-分泌酶水解位点之间水解,从而阻止Aβ形成。正常情况下,细胞外存在纳摩尔级浓度的可溶性Aβ,起到神经营养作用。AD时,APP的异常剪切加工,Aβ的过多产生并由可溶状态向不溶状态的转变是AD发病的中心环节。近些年的研究提示锌离子与APP水解过程中α-、β-和γ-分泌酶之间密切相关。本研究旨在通过对过度表达APPsw的SH-SY5Y细胞给予锌离子及锌离子螯合剂TPEN干预,探讨细胞内锌离子对APP水解过程的影响。实验方法采用稳定转染APPsw基因的SH-SY5Y细胞（APPsw细胞）为研究对象,应用Western Blot技术检测给予锌离子及TPEN后AD AM10、BACE1、Presenilin1、sAPPαsAPPβ、C99、C83及Aβ蛋白表达的变化。应用Zinquin锌离子荧光染色检测给予锌离子及TPEN后,细胞内锌离子浓度的变化。应用MTT技术检测给予锌离子及TPEN后细胞活力的变化。实验结果一、ZnSO4和TPEN对APPsw细胞生存率的影响MTT结果显示,APPsw细胞生存率随培养液中ZnSO4和TPEN农度的升高而降低,选择可使APPsw细胞的生存率降低1.5%、43.9%、16.6%的1μM ZnSO4、70μM ZnSO4阳1μM TPEN作为后续实验的处理因素。二、ZnSO4和TPEN处理对细胞内锌离子浓度的影响Zinquin染色显示：1μM ZnSO4处理APPsw细胞可使细胞内染色与对照组相比略有增强,70μM ZnSO4处理后细胞内染色与对照组相比显著增强（P<0.01）,而1μM TPEN可使细胞内染色与对照组相比明显减弱（P<0.01）。当同时应用70μMZnSO4与1μM TPEN处理细胞时,细胞内染色与对照组相比无显著性差异。三、ZnSO4和TPEN处理对ADAM10、BACE 1和Presenilin 1表达的影响Western Blot结果显示：1μM ZnSO4使ADAM 10表达显著增加,与对照组比较有显著差异（P<0.01）; 70μM ZnSO4使BACE1和Presenilin 1表达显著增加,与对照组比较有显著差异（P<0.05）; 1μM TPEN使BACE 1和Presenilin 1表达显著减少,与对照组相比有显著差异（P<0.05）；同时应用70μM ZnSO4和1μM TPEN时,ADAM10、BACE 1和Presenilin 1的表达与对照组相比均无统计学差异。四、ZnSO4和TPEN处理对APPsw细胞APP水解过程的调节Western Blot结果显示：1μM ZnSO4使sAPPα和C83表达显著增加,并且使sAPPβ和C99表达及Aβ分泌显著减少,与对照组比较有显著差异（P<0.05）；70μMZnSO4使sAPPβ和C99表达及Aβ分泌显著增加,并且使sAPPα和C83表达显著减少,与对照组比较有显著差异（P<0.01）; 1μMTPEN使sAPPβ表达与Aβ分泌显著减少,与对照组相比有显著差异（P<0.05）；同时应用70μM ZnSO4和1μM TPEN时,sAPPα、sAPPβ、C99、C83表达及Aβ分泌与对照组相比均无统计学差异。结论1、APPsw细胞生存率随培养液中ZnSO4和TPEN浓度的升高而降低。2、使用含有ZnSO4的培养液处理APPsw细胞可使细胞内锌离子浓度增加,而用含有TPEN的培养液处理APPsw细胞可使细胞内锌离子浓度减少。3、低浓度（1μM） Zn2+可能通过促进α-分泌酶的表达和水解并抑制β-分泌酶的水解作用,引起Aβ分泌减少。4、高浓度（70μM） Zn2+可能通过促进β-和γ-分泌酶的表达及抑制α-分泌酶的水解作用,引起Aβ分泌增多。5、锌离子螯合剂TPEN可以通过抑制β-和γ-分泌酶的表达,引起Aβ分泌减少。
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