以甘油为底物产二羟丙酮（DHA）微生物的选育及甘油脱氢酶酶学性质的研究

论文摘要

二羟丙酮（DHA）是一种重要的化工原料,在精细化工、制药、食品等方面具有广泛的应用前景。本研究从自然界筛选出21株能够以甘油为唯一碳源产二羟丙酮的菌株,经初步发酵测定发酵液中DHA含量,其中菌株6-8 DHA产量最高达6.2 g/L。对其进行常规生理生化鉴定实验,并结合16S rDNA基因分析,比对结果表明,菌株6-8与Acinetobacter sp. B8-22相似性最高,达99.7%,在细菌分类学上属于假单胞菌目莫拉菌科不动杆菌属,将其命名为Acinetobacter sp.6-8。在研究Acinetobacter sp. 6-8在LB培养基中的生长曲线的基础上,考察了培养时间与培养温度对Acinetobacter sp. 6-8发酵DHA的影响,最终确定37℃时发酵72 h即可获得较高的DHA产量。在摇瓶水平上,分别考察了碳源和氮源对Acinetobacter sp. 6-8发酵产DHA的影响,并对碳氮源综合水平进行了正交实验优化,最终确定采用甘油10.0%、山梨醇2.0%、酵母膏0.5%、玉米浆0.2%作为发酵培养基的碳氮源浓度,以此条件发酵,DHA产量为7.21 g/L,比未优化时DHA产量提高了9.8%;建立了简单且准确测定二羟丙酮（DHA）的高效液相色谱（HPLC）方法,以Alltima C18（5μm,250×4.6 mm）为分离柱,5%甲醇水溶液（0.05%H3PO4调pH至3.0）为流动相,用紫外检测器在203 nm处检测DHA。结果测得DHA标准样品在203nm的保留时间为6.2 min,并测得DHA的线性范围为0.1～10.0 g/L,用HPLC法测得以甘油为底物发酵产DHA发酵液中DHA含量与显色法测得的DHA含量一致。以克雷伯氏菌基因组DNA为模板,扩增得到编码甘油脱氢酶（GDH）基因dhaD,将其克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a（+）上,在E.coli BL21（DE3）中诱导表达,利用表达载体pET-28a（+）上的6·His-Tag标记选用Ni2+柱纯化具有表达活性的甘油脱氢酶（GDH）,纯化后比酶活达到156 U/mg,纯化倍数达4.6倍,回收率为67.4%。并初步研究了该酶的酶学性质:酶反应的最适pH为11.0,在pH7.0～12.0范围内稳定;酶反应的最适温度为30℃,稳定范围为25℃～45℃;Mg2+、Cu2+、Zn2+、K+对酶促反应有一定的激活作用;酶动力学参数以甘油为底物的Km为0.54 mmol/L, Vmax为0.49μmol/（mL·min）,说明了此酶对甘油的亲和性较高。本实验采用了生物全细胞转化的方法,将重组大肠杆菌培养至对数生长后期,经IPTG诱导收集菌体,将其加入转化液中,利用全细胞转化法只需12 h甘油转化为DHA达1.4 g/L。为利用基因工程菌的工业化应用打下了良好的基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 二羟丙酮的性质及应用领域
• 1.1.1 二羟丙酮的性质
• 1.1.2 二羟丙酮的用途
• 1.2 二羟丙酮的生产及市场概况
• 1.3 二羟丙酮的生产方法
• 1.3.1 二羟丙酮的化学合成法
• 1.3.2 二羟丙酮的生物转化法
• 1.4 甘油转化二羟丙酮的生产菌种及甘油的代谢途径
• 1.4.1 自然生产菌种
• 1.4.2 甘油的代谢途径
• 1.4.3 二羟丙酮的代谢途径
• 1.5 二羟丙酮的测定方法
• 1.6 甘油转化二羟丙酮关键酶的研究
• 1.6.1 脱氢酶
• 1.6.2 甘油脱氢酶
• 1.7 本研究的立题背景及内容
• 第二章 以甘油为底物产二羟丙酮菌种的筛选及初步鉴定
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 主要仪器
• 2.2.2 采样与初筛供试菌株
• 2.2.3 培养基
• 2.2.4 试剂
• 2.2.5 菌种筛选
• 2.2.6 甘油测定方法
• 2.2.7 二苯胺显色法检测DHA
• 2.2.8 高效液相色谱检测DHA 方法的建立
• 2.2.9 生长曲线测定
• 2.2.10 菌株鉴定
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 DHA 显色测定法标准曲线
• 2.3.2 菌种初筛结果
• 2.3.3 发酵条件初探
• 2.3.4 菌株鉴定
• 2.3.5 高效液相色谱测定DHA 方法的建立
• 2.4 本章小结
• 第三章 ACINETOBACTER SP.6－8 产二羟丙酮发酵条件的初步研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 主要仪器
• 3.2.2 菌株
• 3.2.3 培养基
• 3.3.4 培养方法
• 3.2.5 甘油测定方法
• 3.2.6 二羟丙酮测定方法
• 3.2.7 生长曲线测定
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 Acinetobacter sp.6－8 在LB 培养基中的生长曲线
• 3.3.2 发酵时间的确定
• 3.3.3 初始甘油浓度的确定
• 3.3.4 酵母膏对Acinetobacter sp. 6－8 发酵产DHA 的影响
• 3.3.5 玉米浆对Acinetobacter sp. 6－8 发酵产DHA 的影响
• 3.3.6 山梨醇的添加对Acinetobacter sp. 6－8 发酵产DHA 的影响
• 3.3.7 产物DHA 添加对Acinetobacter sp. 6－8 发酵产DHA 的影响
• 3.3.8 正交实验优化培养基碳氮源组成
• 3.3.9 温度对Acinetobacter sp. 6－8 发酵产DHA 的影响
• 3.4 本章小结
• 第四章 克雷伯氏菌甘油脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中表达
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 菌株和载体
• 4.2.2 主要仪器
• 4.2.3 培养基及培养条件
• 4.2.4 工具酶及其它试剂
• 4.2.5 基因组DNA 的提取
• 4.2.6 甘油脱氢酶基因的克隆
• 4.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
• 4.2.8 大肠杆菌表达载体的构建及甘油脱氢酶基因的诱导表达
• 4.2.9 重组菌全细胞蛋白SDS-PAGE 分析
• 4.2.10 甘油脱氢酶酶活力测定方法
• 4.2.11 蛋白质含量测定
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 甘油脱氢酶基因dhaD 的扩增及核苷酸序列分析
• 4.3.2 含甘油脱氢酶基因dhaD 的重组载体pET-28a（+）-dhaD 的构建
• 4.3.3 dhaD 基因在大肠杆菌中表达
• 4.3.4 重组大肠杆菌生长曲线的测定
• 4.3.5 重组大肠杆菌全细胞蛋白SDS-PAGE 电泳分析
• 4.3.6 IPTG 诱导时间对重组菌中甘油脱氢酶表达的影响
• 4.3.7 甘油脱氢酶酶活力测定
• 4.3.8 重组大肠杆菌质粒稳定性分析
• 4.4 本章小结
• 第五章 甘油脱氢酶的纯化及其酶学性质研究
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 菌株和质粒
• 5.2.2 主要仪器
• 5.2.3 培养基及培养条件
• 5.2.4 甘油脱氢酶的纯化
• 5.2.5 甘油脱氢酶酶活力测定
• 5.2.6 蛋白质含量测定
• 5.2.7 甘油脱氢酶酶学性质研究
• 5.2.8 含甘油脱氢酶的全细胞转化
• 5.2.9 二羟丙酮的含量测定
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 dhaD 基因在E.coli BL21（DE3）中表达与重组蛋白的纯化
• 5.3.2 甘油脱氢酶最适反应pH 及pH 稳定性
• 5.3.3 甘油脱氢酶最适反应温度及温度稳定性
• 5.3.4 不同金属离子及EDTA 对酶活性的影响
• 5.3.5 甘油脱氢酶Km 值和Vmax 的测定
• 5.3.6 重组大肠杆菌转化甘油生产二羟丙酮（DHA）
• 5.4 本章小结
• 主要结论及展望
• 致谢
• 参考文献
• 作者在攻读硕士学位期间发表的论文