从寄主昆虫血淋巴中获取病原真菌菌体的方法研究

论文摘要

金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）是一类应用广泛的昆虫病原真菌,在昆虫防治中起着重要作用。与化学农药相比,尽管真菌杀虫剂安全,无环境污染,但却存在着杀虫速率缓慢的弱点,这在很大程度上阻碍了真菌杀虫剂的应用。昆虫病原真菌致病机制的研究可为发展新型高效真菌杀虫剂提供依据。真菌突破昆虫表皮障碍侵入寄主血淋巴后,病原真菌侵入昆虫体后主要在血腔内生长增殖,以虫菌体等形式存在于寄主体内血淋巴中,直到寄主死亡。多数昆虫病原真菌能够迅速穿透昆虫体壁,通常在24 小时左右就能够侵入寄主体内,但是,需要一周甚至更长的时间才能使昆虫致死。因此,研究病原真菌在侵入昆虫体内后使寄主致死的机制具有重要意义。弄清病原真菌在侵入昆虫体内后的基因表达情况是致病机制研究的重要内容。从感病昆虫体内直接获取病原真菌菌体,以分离和克隆绿僵菌侵入蝗虫体内后表达的基因,对于研究它们在致病机理中的作用具有非常重要的意义。本文采用正交实验方法,对东亚飞蝗（Locusta migratoria）血细胞裂解及其DNA 和RNA 降解的条件进行了优化。在优化条件下,不仅去除了感病东亚飞蝗血淋巴中的血细胞及DNA 和RNA,而且成功地分离和纯化了绿僵菌（Metarhizium anisopliae）菌体。为后续分离和克隆绿僵菌在蝗虫体内表达的基因,研究它们在致病机理中的作用奠定了基础。主要研究结果如下: 1.对蝗虫引物及绿僵菌引物进行PCR 灵敏度分析。结果为:蝗虫特异引物1、2 能检测出0.1pg 的蝗虫DNA,绿僵菌特异性引物3、4 能检测出1pg 绿僵菌DNA。2.通过正交实验方法,对东亚飞蝗（Locusta migratoria）血细胞裂解及其DNA和RNA降解的条件进行了优化,得出最佳酶解条件为:蛋白酶K的浓度为1mg/ml,作用温度为26℃,时间为60min,脱氧核糖核酸酶（DNAase I）的用量为5U,核糖核酸酶（RNAase A）的浓度为0.5mg/ml,核酸酶作用时间为35min,温度为30℃。3.根据正交试验方案得出的最佳酶解条件组合,按照蝗虫血细胞裂解及DNA和RNA 降解的方法处理感病蝗虫血淋巴,得到的细胞沉淀,按照真菌基因组DNA 提取的方法提取DNA,用绿僵菌特异引物和蝗虫特异引物通过PCR 及RT-PCR 反应进行验证。结果表明,从绿僵菌侵染后的蝗虫血淋巴中分离到的绿僵菌菌体中无蝗虫DNA 和RNA 的污染

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 国内外研究进展
• 1.2.1 昆虫病原真菌孢子萌发和附着胞附着的机制研究
• 1.2.2 昆虫病原真菌穿透寄主表皮的机制研究
• 1.2.3 病原真菌穿透昆虫体壁后的杀虫分子机制
• 1.3 病原真菌侵染寄主昆虫的过程
• 1.4 研究目的
• 1.5 研究内容和技术路线
• 1.5.1 PCR 分析蝗虫和绿僵菌引物的灵敏度
• 1.5.2 分析水洗涤对蝗虫血细胞破裂的影响
• 1.5.3 正交试验优化蝗虫血细胞裂解和DNA 降解的条件
• 1.5.4 从感病蝗虫体内分离纯化绿僵菌菌体及纯度验证
• 1.6 本研究的创新点
• 2 材料与方法
• 2.1 供试菌株与昆虫
• 2.2 培养基
• 2.3 主要仪器
• 2.4 主要试剂
• 2.4.1 提取蝗虫（Locusta migratoria）基因组DNA 所用试剂
• 2.4.2 提取绿僵菌基因组DNA 所用试剂
• 2.4.3 蝗虫血细胞裂解及核酸降解所用试剂
• 2.4.4 PCR 和RT-PCR 所用试剂
• 2.4.5 琼脂糖凝胶电泳与凝胶染色所用试剂
• 2.5 基因组DNA 的制备与定量
• 2.5.1 东亚飞蝗基因组DNA 的提取
• 2.5.2 绿僵菌基因组DNA 的提取
• 2.5.3 基因组DNA 的定量
• 2.6 引物设计及PCR 灵敏度分析
• 2.6.1 东亚飞蝗引物设计
• 2.6.2 绿僵菌引物设计
• 2.6.3 PCR 灵敏度分析
• 2.7 渗透压对血细胞破裂率的影响分析
• 2.8 蝗虫血细胞的裂解及DNA 和RNA 降解技术路线
• 2.9 正交试验
• 2.9.1 确定影响蝗虫血细胞裂解及DNA 和RNA 降解的因素及其水平
• 2.9.2 确定正交表
• 2.9.3 用极差法对正交结果进行直观分析
• 2.9.4 作出各因素水平趋势图
• 2.9.5 对正交结果进行方差分析
• 2.10 绿僵菌侵染飞蝗及绿僵菌菌体的分离和验证
• 2.10.1 东亚飞蝗饲养
• 2.10.2 供试菌株培养及分生孢子悬浮液制备
• 2.10.3 东亚飞蝗局部接种绿僵菌
• 2.10.4 东亚飞蝗血淋巴收集及处理
• 2.10.5 感病蝗虫绿僵菌菌体的分离过程
• 2.10.6 提取分离到的绿僵菌菌体的DNA 并进行纯度分析
• 3 结果
• 3.1 PCR 灵敏度分析结果
• 3.1.1 蝗虫特异性引物PCR 灵敏度分析结果
• 3.1.2 绿僵菌特异性引物PCR 灵敏度分析结果
• 3.2 水洗涤对蝗虫血细胞破裂的影响
• 3.2.1 蝗虫血细胞经水洗涤后的形态变化
• 3.2.2 不同体积洗涤水对蝗虫血细胞影响效果
• 3.3 正交实验分析结果
• 3.3.1 直观法分析正交实验结果
• 3.3.2 各因素水平趋势图
• 3.3.2 方差分析正交试验结果
• 3.4 感病蝗虫绿僵菌菌体的分离及验证结果
• 3.4.1 感病蝗虫绿僵菌菌体分离过程
• 3.4.2 从感病蝗虫血淋巴中分离纯化到的绿僵菌菌体提取基因组DNA 后进行纯度分析
• 4 讨论
• 4.1 超纯水洗涤对蝗虫血细胞破裂的影响
• 4.2 引物的灵敏度对从感病蝗虫体内获得绿僵菌菌体纯度分析的影响
• 4.3 处理细胞的温度对最终结果的影响
• 5 结论与后续工作
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 独创性声明
• 学位论文版权使用授权书