新型一氧化氮合酶抑制剂对心肌细胞内游离钙浓度的影响

论文摘要

一、实验背景在哺乳动物体内存在三种形式的一氧化氮合酶（nitric oxidesynthase，NOS），即神经元型一氧化氮合酶（neuronal NOS，nNOS or NOS1）、诱导型一氧化氮合酶（inducible NOS，iNOS or NOS2），内皮型一氧化氮合酶（endothelial NOS，eNOS or NOS3），三者均以左旋精氨酸为底物，生成一氧化氮（nitric oxide，NO）和瓜氨酸。NO参与调整包括神经、泌尿、免疫、消化、呼吸等系统的功能。三种亚型的NOS均可以在心肌中表达，一般认为NOS1位于心肌传导系统及神经元中；NOS2在炎症因子刺激下，心脏各种组织均可以表达；NOS3在血管内皮、心肌细胞、心内膜处表达。NOS产生的NO对维持心脏功能起着重要作用，包括对心肌收缩功能的调整，影响细胞的能量产生、底物代谢，细胞生长及存活。NO可以通过两种方式发挥其作用：环磷酸鸟苷（3’,5’-cyclic guanosine monophosphate，cGMP）依赖途径及对蛋白巯基的亚硝基化作用。NO可激活的鸟苷酸环化酶，促进cGMP生成，后者继续激活蛋白激酶G而发挥作用。NOS亚型的在心肌中的亚细胞定位是调整NO作用的一个重要因素，NOS3位于肌膜的凹穴处，靠近β肾上腺素能受体，NOS3／NO抑制心肌对β肾上腺素能受体激动剂的反应性。而NOS1以肌浆网兰尼碱受体（ryanodine receptor，RyR）为靶组织，可以增强心肌收缩时肌浆网的钙释放。NOS1与NOS3对心肌收缩功能起着相反的调节作用。心肌正常的时候，不表达NOS2，在某些特定的病理状态下，在炎症和细胞因子诱导心肌才丌始表达NOS2，产生大量的NO。心肌中的NOS2位于细胞质的囊泡和内质网中，在缺血再灌注的时候，可以对心脏起到保护作用。但更多的时候，NOS2的表达，严重影响着心肌功能，目前研究较多的是NO对心肌收缩抑制的机制。NOS2的表达可以抑制心肌细胞中钙瞬变、降低心肌收缩力和降低心肌对β受体激动剂反应性。越来越多的证据表明，NO可以对兴奋收缩耦联的多个方面进行调节，包括：受体信号传导、L-型钙通道活性、通过肌浆网RyR进行的钙释放及线粒体呼吸过程。精氨酸（文中所提到的精氨酸均为左旋精氨酸）是NOS的唯一底物，同时也是精氨酸酶的底物。因此精氨酸酶可以通过对底物的竞争性利用而限制NO的产生。精氨酸酶一般理解为鸟氨酸循环最后一个酶，体内存在两种形式的精氨酸酶，一种是肝脏型精氨酸酶（精氨酸酶Ⅰ），存在于细胞质中，其主要功能是合成尿素；另一种是线粒体型精氨酸酶（即精氨酸酶Ⅱ），广泛存在体内的多种组织，参与多胺、脯氨酸、谷氨酸等物质的合成。在心脏组织中两种精氨酸酶均可以被检测出。但是在鼠心肌细胞中，仅发现精氨酸酶Ⅱ表达。以BEC抑制精氨酸酶的活性，可以增加钙依赖的NOS的活性和增加NO的产生。精氨酸是可以影响NOS的另外一个因素。在内皮细胞中，精氨酸浓度是NOS的Km值的2-3倍，理论上不会因NOS底物耗竭而限制NOS活性和NO的产生。相应的，外源性的精氨酸也不应影响NOS的活性。但是，在一些特定的病理过程中，给予额外的精氨酸能够增加NO的产生。这种现象被成为精氨酸颠倒现象（L-Arginine Paradox）：细胞内精氨酸的浓度对于NOS反应来说是饱和的，但是外源性的精氨酸还是可以增加NO的产生。二、实验目的液相合成法合成的由两分子精氨酸和一分子赖氨酸组成的三肽（以下均简称：三肽），以体外培养的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导表达NOS2的巨噬细胞、表达NOS3的脐静脉内皮细胞、表达NOS1和NOS3的SD乳鼠心肌细胞（cardiac myocytes，CMs）为对象，硝酸还原酶法检测三肽对不同细胞的NO合成的抑制效果；白介素6（interleukin-6，IL-6）联合LPS诱导心肌NOS2表达，免疫印记法（western blotting）等技术检测NOS2蛋白的表达。以表达NOS2的心肌细胞为研究对象，进一步研究三肽对β肾上腺素能受体激动剂异丙肾上腺素（isoproterenol，ISO）刺激心肌细胞游离钙浓度变化的影响，给予不同的钙通道阻滞剂，包括肌膜L-型通道、肌浆网兰尼碱受体（ryanodine receptor，RyRs）、肌醇1，4，5-三磷酸受体（inositol 1，4，5,-triphosphate rceptor，IP3R）。明确参与三肽发挥效应的钙通道类型。同时探讨共同以精氨酸为底物的精氨酸酶对正常心肌细胞和表达NOS2的心肌细胞中ISO诱导心肌细胞内游离钙浓度变化的影响，系统地探讨NOS、精氨酸酶、精氨酸三者对心肌功能影响的程度及相互间的影响。三、实验方法1、LPS处理巨噬细胞24 h表达NOS2，检测三肽对乳鼠心肌细胞、脐静脉内皮细胞和表达NOS2的巨噬细胞中NO的浓度，明确三肽对相应的NOS亚型的抑制效果。2、IL-6联合LPS处理心肌细胞24 h，western blouing检测6、12、24 h三个时间点NOS2的蛋白表达情况。3、表达NOS2的心肌细胞为对象，给予L-NNA、不同浓度的三肽处理12 h，研究三肽对表达NOS2的心肌细胞NO抑制作用，寻找同L-NNA具有相同抑制效果的三肽浓度。4、正常心肌细胞，给予精氨酸酶抑制剂S-（2-boronoethyl）-L-cysteine（BEC）和NOS1抑制剂vinyl-L-N-5-（1-imino-3-butenyl）-L-omithine（L-VNIO）处理，实验分为BEC组、L-VNIO组和BEC+L-VNIO组．给予相应处理后，取上清检测NO值。明确精氨酸酶对心肌细胞NO产生的影响。5、表达NOS2的心肌细胞为对象，激光共聚焦显微镜（Laser Scan ConfocalMicroscope，LSCM）检测三肽对ISO刺激的心肌细胞胞内游离钙浓度变化的影响。同时比较对NO具有相同抑制效果的低浓度的三肽同高浓度的L-NNA对ISO刺激的心肌细胞内游离钙浓度变化的影响，明确NOS的细胞定位是细胞功能调整的重要方式。6、分别以维拉帕米（verapamil）阻滞L-型通道、普鲁卡因（procaine）阻断RyR、肝素（heparin）阻断IP3R后，各组均给予三肽。检测上述处理后心肌细胞钙浓度的变化。明确三肽升高心肌内游离钙浓度的途径。7、正常的心肌细胞，分为ISO、ISO+BEC、ISO+L-VNIO、ISO+BEC+L-VNIO组，各组给予相应处理后。上机检测细胞内游离钙浓度。明确精氨酸酶及NOS1对心肌功能的影响。8、表达NOS2的心肌细胞，分别给予三肽、L-VNIO、BCE、三肽+L-VNIO处理。检测各组细胞内钙浓度，明确精氨酸酶对表达NOS2心肌细胞的钙浓度的影响。四、统计学处理采用SPSS12．0统计软件进行数据分析，结果以（?）+s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验，方差不齐时采用Tamhane法，处理组同对照组间的多重比较采用Dunnett法；分析各处理方式的主效应及交互效应采用析因设计资料的方差分析；两组间均数比较采用两独立样本t检验，P<0．05为显著性差异。五、实验结果1、三肽对各种细胞NO产生的影响在表达NOS2的巨噬细胞中，三肽、L-NNA、及对照组的NO值（umol／L）分别为208．2±19．3、279．5±20．7、308．9±17．1，进行单因素方差分析显示，各组间NO浓度差异有显著性意义（F=73．553,P=0．000）。LSD法进行组间比较结果显示：三肽能够明显抑制巨噬细胞NO的产生（P=0．000），且其效果优于非选择性的NOS抑制剂L-NNA（P=0．000），三肽显示出对NOS2的良好的抑制效果。在表达NOS3的内皮细胞中，三肽、L-NNA及对照组的NO值（umol／L）分别为179．5±9．4、157．8±13．9、188．2±11．6，进行单因素方差分析结果显示，三组间NO值差异有显著性意义（F=17．660，P=0．000）。LSD法进行组间比较结果显示：三肽组与对照组间NO浓度的差异没有显著性意义（P=0．110）。L-NNA组同三肽组（P=0．000）及对照组相比（P=0．000），则降低了NO的产生。三肽对内皮细胞中的NOS3活性影响较小。在心肌细胞中，三肽、L-NNA、及对照组的NO值（umol／L）分别为55．5±7．5、30．2±5．9、61．4±9．9，单因素方差分析结果显示，三组间NO值的差异有显著性意义（F=41．061，P=0．000）。LSD法进行组间比较结果显示：三肽组与对照组NO浓度的差异没有显著性意义（P=0．101），但L-NNA组较其他两组明显降低了心肌NO的产生（P=0．000），三肽对心肌细胞中的NOS3和NOS1活性影响较小。另外，给予正常的心肌精氨酸处理，对心肌NO的产生的影响没有显著性意义（P=0．228）。值得注意的是，三肽组同精氨酸组相比，二者NO值的差异有显著性意义（P=0．006），精氨酸组的NO值明显高于三肽组。2、心肌细胞NOS2表达IL-6联合LPS处理心肌细胞6、12、24 h，6 h后心肌NOS2开始表达增加，并随着处理时间延长，NOS2表达不断增加，三个时间点的NOS2的蛋白表达量分别是100、157．1±9．4、178．1±11．0。单因素方差分析结果显示，各时间点的NOS2蛋白表达的差异有显著性意义（F=187．101，P=0．000）。以Tamhane法进行各组间比较，24h同6h（P=0．000）及12h（P=0．003）相比，24 h后NOS2蛋白表达最为明显。3、NOS抑制剂对表达NOS2心肌细胞NO浓度的影响表达NOS2的心肌细胞，给予三肽、L-NNA、精氨酸处理，检测各组中NO值。对照组、三肽组、L-NNA组及精氨酸组的NO值分别是：150．0±13．5、111．0±15．2、130．2±15．2和168．2±11．5。采用单因素方差分析显示，各处理组间NO值的差异有显著性意义（F=29．230，P=0．000）。LSD法进行组间比较结果显示：同对照组相比，三肽（P=0．000）和L-NNA（P=0．001）明显抑制心肌中NO的产生，而精氨酸则促进心肌细胞中NO合成（P=0．003）。三肽对表达NOS2的心肌NO合成的抑制效果明显优于L-NNA（P=0．002）。心肌细胞给予不同浓度的三肽，检测各组中NO值。0．2、0．4、0．6和0．8mmol／L组的NO值分别是：143．4±11．3、128．6±10．1、119．2±9．2和114．3±12．3。采用单因素方差分析结果显示，各处理组间的NO值的差异有显著性意义（F=20．290，P=0．000）。LSD法进行组间比较结果显示：同对照组相比，三肽0．2mmol／L对心肌细胞NO的合成具有抑制效果（P=0．004），0．4mmol／L组的NO值，同1mmol／L的L-NNA组相比较，差异没有显著性意义（P=0．490）；4、BEC和L-VNIO对心肌细胞NO浓度的影响在正常的心肌细胞中，给予精氨酸酶抑制剂BEC及NOS1抑制剂L-VNIO处理后，对照组、BEC组、L-VNIO组及BEC+L-VNIO组NO值分别为：61．4±9．9、72．8±9．4、44．8±7．9和51．2±7．0。采用析因设计资料的方差分析，结果显示给予BEC可以增加NO的产生（F=10．620，P=0．002），给予NOS1抑制剂L-VNIO可以显著抑制NO的产生（F=48．909，P=0．000）。同时给予BEC和L-VNIO，两种处理因素的交互效应不显著（F=0．838，P=0．366）。5、NOS抑制剂对表达NOS2的心肌细胞游离钙浓度的影响同正常心肌给予ISO刺激时的钙离子浓度改变相比，心肌表达NOS2后，对ISO反应性明显减弱。前者钙离子浓度为172．0±8．0，而后者为125．6±14．0，以两独立样本的t检验进行统计分析，结果显示两者的差异有显著性意义（t=9．099，P=0．000）。表达NOS2的心肌细胞给予空白对照、精氨酸、三肽、三肽+精氨酸处理后，心肌细胞中游离钙浓度峰值分别为123．6±13．1、114．3±9．3、157．4±15．4、135．5±12．9。以单因素方差分析结果显示，各处理组间的差异有显著性意义（F=40．726，P=0．000）。LSD法进行组间比较结果显示：在表达NOS2的心肌细胞中，同对照组相比，三肽（1mmol／L）做为NOS2抑制剂，可以明显促进ISO刺激的心肌中游离钙浓度的升高（P=0．000）。精氨酸则可以抑制ISO刺激的心肌中游离钙浓度的升高（P=0．007），精氨酸组同三肽+精氨酸组相比，两组细胞的游离钙浓度的差异有显著性意义（P=0．000），三肽可以减弱精氨酸对ISO诱导的心肌钙升高的抑制作用，表明精氨酸对心肌钙浓度的影响，可能是通过NOS2途径。分析对心肌细胞NO产生具有相同抑制效果的三肽（0．4mmol／L）组和L-NNA（1mmol／L）组，结果显示，0．4mmol／L三肽对ISO诱导心肌细胞游离钙浓度升高的促进作用明显优于后者（P=0．003）。6、不同钙通道阻滞剂对三肽效应的影响。表达NOS2的心肌细胞，给予三肽、三肽+维拉帕米、三肽+肝素及三肽+普鲁卡因处理，ISO刺激心肌，检测各组细胞内钙浓度的变化。上述四组检测钙的结果分别为152．0±13．3、137．1±10．9、150．0±11．0、129．8±8．3。单因素方差分析结果显示，各组问的差异有显著性意义（F=9．273，P=0．000）。以Dunnett法进行处理组同对照组间的多重比较，结果显示，同对照组相比，给予维拉帕米（P=0．009）和普鲁卡因（P=0．000）可以减弱三肽的效应。肝素（P=0．957）组同对照组的差异不具有显著性差异。提示抑制NOS2引起心肌钙浓度升高的机制可能是通过改善多种钙通道的功能而实现。7、精氨酸酶抑制剂对ISO刺激的正常心肌时胞内游离钙浓变化的影响给予空白对照、BEC、L-VNIO、BEC+L-VNIO处理，心肌细胞中游离钙浓度峰值四组分别为172．0±8．0、188．5±11．1、143．0±8．9、146．7±8．3。采用析因设计资料的方差分析，结果显示：L-VNIO明显抑制ISO对心肌的钙浓度作用（F=147．008,P=0．000）。BEC明显促进ISO对心肌的钙浓度作用（F=11．460,P=0．002）。同时给予BEC和L-VNIO，两者组合的交互效应显著（F=5．356,P=0．026），分析BEC促进心肌钙浓度，而L-VNIO抑制钙浓度，表明BEC和L-VNIO存在拮抗效应，表明精氨酸酶对心肌钙的影响机制可能是通过NOS1途径。8、BEC对ISO刺激的表达NOS2的心肌时胞内游离钙浓变化的影响表达NOS2的心肌细胞，分别给予三肽、L-VNIO、BCE、三肽+L-VNIO处理。上述各组游离钙浓度分别为：152．0±13．3、109．9±7．6、133．1±10．9和139．2±12．2。检测上述处理对ISO诱导的心肌细胞内钙浓度变化的影响，单因素方差分析结果显示，各处理组间的差异有显著性意义（F=17．633，P=0．000）。LSD法进行组问比较结果显示：在表达NOS2的心肌细胞中，同对照组相比，给予NOS1抑制剂，可以抑制ISO诱导的心肌细胞内游离钙的升高（P=0．017）；而给予精氨酸酶抑制剂，对ISO诱导的心肌的钙改变未见明显影响（P=0．427）；同对照组相比，同时给予L-VNIO和三肽，可以促进ISO诱导的心肌细胞的钙升高（P=0．045）。五、结论1、LPS刺激巨噬细胞可以表达NOS2，LPS+IL-6可以诱导心肌细胞表达NOS2。2、三肽对NOS2具有较好的选择性及抑制性。3、在正常心肌细胞中，抑制心肌中的精氨酸酶可以促进心肌对ISO的反应性，其机制可能是通过NOS1实现的。4、表达NOS2的心肌对ISO的反应性降低。三肽抑制NOS2，可以增强心肌对ISO的反应。其机制是通过影响多种钙通道实现的。5、精氨酸能够降低表达NOS2的心肌对ISO的反应性。其机制可能是通过NOS2的途径实现。

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