四种真菌毒素的HPLC-FLD联合分析方法的研究

论文摘要

真菌毒素（Mycotoxin）是产毒真菌分泌产生的,能引起人畜各种损害的次生代谢产物,主要由曲霉属真菌、青霉属真菌和镰刀菌属真菌产生。到目前为止,已发现的真菌毒素有400多种,这些真菌毒素广泛存在于多种农产品中。由于真菌毒素具有急性和慢性毒性作用,甚至致畸、致癌、致突变等作用,对人和动物危害极大。为了最大限度减少或避免真菌毒素造成的危害,许多国家和地区已对农产品中的真菌毒素含量都制定了限量标准和相应的检测方法。目前,常见的检测方法多针对单一真菌毒素,存在分析效率低和分析成本高的问题,而且单一真菌毒素分析可能存在检测盲点,使得消费者面临存在较大的真菌毒素暴露风险。为此开发快速、高灵敏度和高通量的真菌毒素分析方法不仅可以有效提高分析效率,同时也能最大程度降低消费者的暴露风险,有效保障农产品安全。本研究以四种常见的真菌毒素：黄曲霉毒素B1 （Aflatoxin B1, AFB1）、赭曲霉毒素A （Ochratoxin A, OTA）、玉米赤霉烯酮（Zearalenone, ZEN）和橘霉素（Citrinin, CIT）为研究对象,建立了AFB1、CIT、OTA、ZEN联合提取的快速、简易、经济、有效的提取方法,即QuEChERS （Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe）方法和同时分析检测这四种真菌毒素的HPLC-FLD （Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography coupled with Multi-Channel Fluorescence Detector）方法。四种真菌毒素的QuEChERS联合提取效果和HPLC-FLD的同时分离检测表明,该研究可以同时实现痕量AFB1、CIT、OTA、ZEN的定量分析检测,并在此基础上,对采集的70份谷物样品进行了真菌毒素的分析检测。1真菌毒素HPLC-FLD联合检测方法的建立为了建立真菌毒素HPLC-FLD联合检测方法,首先比较了有机溶剂（甲醇、乙腈）,6种C18色谱柱和3种柱温对四种真菌毒素的液相分离效果,分析了磷酸对色谱峰型、保留时间和分离度的影响,并借助DryLab色谱模拟软件分析验证了最佳流动相条件。其次分析了AFB1、CIT、OTA和ZEN的荧光特性,重点分析了CIT随溶液pH值的变化规律。在上述分析结果的基础上,建立了以Intersil ODS-3 （250mm×4.6 mm,5μn）为固定相,磷酸调节pH=2.7的50%（v/v）乙腈水溶液为流动相,0.8 mL/min的流速、30℃的柱温和FLD为检测器的AFB1、CIT、OTA和ZEN联合分析的HPLC-FLD方法。在该条件下,AFB1、CIT、OTA和ZEN的保留时间分别为：7.2、15.5、17.9和19min,线性检测范围分别为0.5～6 ng.1～15ng、0.5～6 ng和10～100 ng,线性系数（R2）分别为0.9918、0.9918、0.9975和0.9984,其线性回归方程依次为：y=842680x+224255, y=2101765x一70546,y=2948376x-634601和y=79111x-285656.2真菌毒素联合提取净化方法的建立由于AFB1.OTA和ZEN为非水溶性物质,而CIT具有一定的水溶性和弱酸性,因此单一的溶剂难以实现对AFB1.CIT.OTA和ZEN的同时提取。为此采用液液萃取（Liquid-Liquid Extraction,LLE）和QuEChERS方法,比较了不同混合溶剂对四种真菌毒素的提取效果。结果表明,在LLE中,以24%乙酸乙酯-42%乙腈-14%甲醇-5%冰乙酸-15%水混合溶液为提取液时,对AFB1、CIT.OTA和ZEN的提取效果较好,回收率分别为80.08%、60.44%、91.53%和102.03%；在QuEChERS中,以60%乙腈-5%冰乙酸的提取时效果较好,AFB1、CIT、OTA和ZEN的回收率分别为80.65%、69.95%、90.56%和96.63%。相对于LLE方法,QuEChERS方法操作简单、快速和安全,采用更为简单的提取液（60%乙腈-5%乙酸-35%水）,且对AFB1、CIT、OTA和ZEN的同时提取效果更优,更适合于对这四种真菌毒素的同时提取,因此实验选择QuEChERS方法为AFBl、OTA、CIT和ZEN的样品前处理方法。3真菌毒素HPLC-FLD联合检测方法的评价和实际样品的测定通过对四种真菌毒素QuEChERS-HPLC-FLD检测方法的多项指标分析,得到AFB1、CIT、OTA和ZEN的检出限分别为：2.12、5.46、2.39和53.10μg/kg,定量限分别为：8.48、21.82、9.57和212-38μg/kg。在AFB1、OTA和ZEN国家限量标准和CIT行业限量标准的加标水平下,饲料和大米加标回收率均在75%-120%之间,标准偏差在1.22-5.81之间。在此基础上对70份谷物样品进行分析,结果显示2份样品含OTA、6份样品含有AFB1和4份样品含有ZEN,其中2份样品含有AFB1和ZEN,所有样品中未检出CIT。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 第一章 文献综述
• 1 研究背景
• 1.1 真菌毒素
• 1.2 真菌毒素的毒理作用
• 1.3 真菌毒素的限量标准
• 1.4 真菌毒素的检测方法
• 1.4.1 样品前处理技术
• 1.4.2 色谱分析方法
• 1.5 真菌毒素分析中存在问题
• 2 研究的目的、意义及主要内容
• 2.1 研究目的和意义
• 2.2 主要研究内容
• 第二章 四种常见真菌毒素的HPLC-FLD分析检测方法的建立
• 1 材料
• 1.1 主要试剂
• 1.2 仪器设备
• 2 实验方法
• 2.1 真菌毒素标准液
• 2.2 流动相的选择
• 2.3 固定相的选择
• 2.4 流动相的优化
• 2.5 检测波长的选择
• 2.6 柱温的选择
• 2.7 HPLC-FLD检测方法的建立
• 3 结果与分析
• 3.1 流动相的选择
• 3.2 固定相的选择
• 3.3 流动相的优化
• 3.4 检测波长的选择
• 3.5 柱温的选择
• 3.6 HPLC-FLD检测方法的建立
• 4 小结与讨论
• 4.1 小结
• 4.2 讨论
• 4.2.1 影响色谱分离的因素
• 4.2.2 多通道荧光定性分析
• 4.2.3 灵敏度的影响因素
• 第三章 四种常见真菌毒素的样品前处理方法的建立
• 1 材料
• 1.1 实验材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 仪器设备
• 2 实验方法
• 2.1 真菌毒素标准液
• 2.2 样品的准备
• 2.2.1 空白样品
• 2.2.2 加标样品
• 2.3 液液分配
• 2.3.1 单一溶剂与水的混合液
• 2.3.2 两种有机溶剂与水的混合液
• 2.3.3 三种有机溶剂与水的混合液
• 2.3.4 不同pH值的提取液
• 2.4 QuEChERS方法的建立
• 2.4.1 提取液的选择
• 2.4.2 净化方法的选择
• 2.5 回收率的计算
• 3 结果与分析
• 3.1 LLE方法的确立
• 3.1.1 单一溶剂与水的混合液
• 3.1.2 两种有机溶剂与水的混合液
• 3.1.3 三种有机溶剂与水的混合液
• 3.1.4 不同pH值的提取液
• 3.2 QuEChERS方法的确立
• 3.2.1 提取液的选择
• 3.2.2 净化方法的选择
• 4 小结与讨论
• 4.1 小结
• 4.1.1 液液萃取
• 4.1.2 QuEChERS萃取
• 4.1.3 谷物样品的前处理方法
• 4.2 讨论
• 4.2.1 提取液的选择
• 4.2.2 净化方法的选择
• 第四章 HPLC-FLD检测方法的评价和谷物样品分析
• 1 材料
• 1.1 主要材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器设备
• 2 方法
• 2.1 真菌毒素混合标准液
• 2.2 空白样品准备
• 2.3 HPLC-FLD方法的分析步骤
• 2.3.1 提取
• 2.3.2 浓缩
• 2.3.3 色谱分析
• 2.4 HPLC-FLD方法的评价
• 2.4.1 检出限和定量限
• 2.4.2 回收率和精密度
• 2.4.3 方法的选择性
• 2.5 谷物样品的测定
• 3 结果与分析
• 3.1 检出限和定量限
• 3.2 回收率和精密度
• 3.3 方法的选择性
• 3.4 谷物样品的测定
• 4 小结与讨论
• 4.1 小结
• 4.1.1 HPLC-FLD方法评价
• 4.1.2 谷物样品分析
• 4.2 讨论
• 第五章 结论与展望
• 1 主要结论
• 1.1 HPLC-FLD联合检测方法的建立
• 1.2 联合提取方法的建立
• 1.3 真菌毒素联合提取分析方法的评价和实际样品测定
• 2 展望
• 2.1 方法的检出限
• 2.2 方法的选择性
• 参考文献
• 致谢