论文摘要
我国食管癌的发病率居世界首位,尤其是在华北太行山一带,更是当地癌症死亡的主要原因。所以从分子水平认识食管癌的发病机制,寻找食管癌恶性转化的分子靶点及靶向治疗食管癌成为当前研究的热点。PI3K/Akt信号通路是一个进化上保守的信号转导通路,它控制着细胞生长、凋亡及血管生成等生物学功能,研究表明,该通路的异常与肿瘤的发生、发展及转移等密切相关。Akt,也被称为蛋白激酶B,在PI3K/Akt信号传导通路中起关键作用。在外界生长因子等信号的刺激下,细胞表面的受体酪氨酸激酶激活PI3K产生PIP3（磷脂酰-3-磷酸肌醇）,进而磷酸化Akt,使其活化,活化的Akt通过其下游基因调节细胞的增殖、分化及迁徙,并参与血管形成。研究表明,在胃癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌等恶性肿瘤中Akt均高表达。研究表明,Akt在食管癌组织中高表达。PHLPP是Gao等新发现的一种天然的抑癌基因,是一种富含亮氨酸的色氨酸／苏氨酸蛋白激酶,位于18号染色体上,属于PP2C激酶。PHLPP蛋白可以脱下Akt的疏水基团Ser473位点一个磷酸分子,使Akt失活,从而实现对Akt及其下游激酶的活性的负调控,发挥抑癌基因的功能,拮抗PI3/Akt信号系统,具有抑制肿瘤细胞生长与迁移能力,促进细胞凋亡的作用。已有报道表明,在结肠癌、脑神经恶性胶质瘤、卵巢癌等一些常见肿瘤中,PHLPP水平显著降低,而Akt的磷酸化水平则明显升高。但关于PHLPP与食管癌关系的研究却鲜有报道。反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides,ASODN）技术是根据核酸碱基互补配对的原则设计出能与靶基因特异性结合RNA,从而影响下游靶基因的表达,进一步抑制其功能。ASODN具有特异性强、操作简单、作用效果好等特点,近年来,已广泛用于基因方面的研究。为探讨PHLPP与食管癌发生、发展的关系,本研究将不同浓度的PHLPP ASODN转染食管癌EC9706细胞,采用免疫细胞化学方法及Western blot检测细胞中PHLPP、Akt及p-Akt蛋白的表达,采用原位杂交技术检测细胞中PHLPP mRNA的表达；采用MTT法及流式细胞仪检测细胞生长及细胞周期情况,采用TUNEL法及流式细胞术检测细胞凋亡情况。方法（1）将PHLPP ASODN、正义序列和无义序列分别转染食管鳞癌细胞EC9706细胞,并将细胞分组如下：5、10及15μmol/L的PHLPP ASODN转染EC9706细胞24、48及72h,正义对照组（15μmol/LSODN）、无关对照组（15μmol/L N-ODN）及正常对照组（常规培养液）。（2）采用免疫细胞化学法和Western blot分别检测各组细胞中PHLPP、Akt及p-Akt蛋白的表达。（3）采用原位杂交检测各组细胞中PHLPP、Akt及p-Akt mRNA的表达。（4）采用MTT法检测各组细胞的增殖情况。（5）采用流式细胞仪检测各组转染72h细胞周期和细胞凋亡的变化。（6）采用TUNEL检测各组转染72h细胞凋亡。（7）统计学处理：统计分析均采用SPSS 13.0软件处理数据。计量资料均用均数±标准差（x±s）来表示,两组均数的比较应用t检验进行统计分析,两组以上均数的比较其数据应用单因素方差分析。检验水准设为a=0.05。结果（1）免疫细胞化学结果表明,5、10及15μmol/L的PHLPP ASODN转染EC9706细胞24、48及72h.与各对照组相比,各转染组细胞中PHLPP蛋白的表达具有不同程度的减弱,且差异均有统计学意义（P<0.05）,同一转染浓度不同转染时间点及同一时间点不同转染浓度两两比较,差异均有统计学意义（P<0.05）。（2）与各对照组相比,各转染组细胞中Akt蛋白的表达无明显改变,且差异无统计学意义（P>0.05）,但p-Akt蛋白的表达明显增高,差异均有统计学意义（P<0.05）,且具有浓度依赖性和时间依赖性。（3） Western blot结果显示,与对照组相比,15μmol/L PHLPP ASODN转染EC9706细胞24、48及72h组,各细胞PHLPP蛋白表达量均降低（P<0.05）,以转染后72h降低最为明显,且各组间差异有统计学意义（P<0.05）,且具有时间依赖性。各组细胞中p-Akt蛋白表达量显著增高（P<0.05）,以转染后72h升高最为明显（P<0.05）；但各组细胞中Akt表达量无显著差异（P>0.05）。（4）原位杂交结果表明,与各对照组相比,各转染组细胞中PHLPP mRNA的表达均明显减弱,且随转染浓度的增加及时间的延长而减弱,差异具有统计学意（P<0.05）。（5）与各对照组相比,各转染组细胞中p-Akt mRNA的表达明显增强,且差异均有统计学意义,具有浓度依赖性和时间依赖性；各转染组细胞中AktmRNA的表达无显著性差异（P<0.05）。（6）细胞增殖结果表明,5、10及15μmol/L的PHLPP ASODN转染EC9706细胞24、48及72h,各转染组细胞相对增长率均增高,且随转染浓度的增高及时间的延长而增加,且差异均有统计学意义,15μmol/L的PHLPP ASODN转染EC9706细胞72h效应最强。（7）流式细胞仪检测表明,5、10及15μmol/L的PHLPP ASODN转染EC9706细胞72h,与各对照组相比,G0/G1期细胞所占比例明显减少,S期细胞比例增加,差异具有统计学意义,G0/G1期细胞所占的比例随转染浓度的增加而减少,S期细胞比例S期细胞比例增加而增加,三个浓度间两两比较,差异均有统计学意义（P<0.05）。（8）流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示,15μmol/L的PHLPP ASODN分别转染EC9706细胞24、48及72h,与各对照组相比,各转染组早期凋亡细胞及晚期凋亡细胞所占的比例均明显减少,且具有统计学意义,随时间的延长,减弱更为明显,且不同时间点间两两比较差异具有统计学意义（P<0.05）。（9） TUNEL检测细胞凋亡结果显示,15μmol/L的PHLPP ASODN分别转染EC9706细胞24、48及72h,与各对照组相比,各转染组凋亡细胞数明显减少,且具有时间依赖性,各时间点间两两比较,差异有统计学意义（P<0.05）。结论（1） PHLPP ASODN可以特异性抑制食管鳞癌EC9706细胞中PHLPP蛋白及mRNA的表达,同时可上调p-Akt蛋白及mRNA的表达；提示PHLPP可抑制细胞p-Akt的表达,从而阻断PI3K/Akt信号通路。（2） PHLPP ASODN可促进食管鳞癌EC9706细胞细胞的生长,抑制细胞的凋亡。提示PHLPP具有抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡的作用。