论文摘要
蛋白质巯基（S-）亚硝基化修饰是一种新近发现的蛋白质翻译后修饰方式,即一氧化氮（nitric oxide,NO）作用于蛋白质半胱氨酸巯基（-SH）生成巯亚硝基（-SNO）的过程。研究表明NO通过蛋白质S-亚硝基化修饰影响蛋白质的活性与功能,属于一种氧化还原信号的转导机制。特别是在缺血性心脏病中,提高心肌组织中的蛋白S-亚硝基化修饰水平,能发挥一定的心肌保护作用。目前,对心肌组织中潜在的S-亚硝基化修饰靶点还缺乏系统全面的研究。一些在临床上广泛应用,且能提高组织中NO水平的抗心肌缺血药物,其药理效应是否与心肌蛋白S-亚硝基化修饰水平的改变有关也尚不清楚。为此,本文开展了以下研究工作:采用NO供体—巯基-亚硝基-谷胱甘肽（GSNO）对大鼠心肌蛋白进行体外孵育,采用Biotin switch法纯化S-亚硝基化蛋白,经双向电泳（2-DE）分离,基质辅助电离激光解吸-飞行时间-串联二级质谱（MALDI—TOF-MS/MS）以及候选Western blot技术进行蛋白鉴定。结果共确定了10种蛋白,其中GAPDH用Westernblot法进行了验证。其中,腺苷酸激酶1（AK1）是一个新发现的S-亚硝酰化修饰靶点,其活性可以被GSNO,而不是GSSG所抑制;且这种抑制作用可以被DTT逆转,说明S-亚硝基化修饰可能是一种新的AK活性的调节机制。采用10mg·kg-1剂量的硝酸甘油腹腔注射,诱导大鼠心肌蛋白S-亚硝基化修饰。采用Biotin switch法纯化S-亚硝基化修饰蛋白,2-DE分离,MALDI—TOF-MS/MS鉴定,共确定17种蛋白。其中磷酸甘油酸激酶1、醛缩酶A、抗氧化蛋白1、3和6、NDPK、transthyretin等为首次发现的S-亚硝基化修饰蛋白。这些所发现的蛋白在调节心肌收缩,清除氧自由基,改善能量代谢等方面发挥着重要作用,而且S-亚硝基化修饰往往是调控这些酶活性的关键。因此推测硝酸甘油在体内发挥的药理作用与调节蛋白S-亚硝基化修饰有关。采用大鼠心肌缺血/再灌注损伤模型,以血清肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）为指标,考察参麦方抗心肌缺血再灌注损伤的作用,Griess法测定血清NO含量,Western blot法检测心肌组织内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的表达变化;并分别采用Biotin switch法和DAN荧光法进行半定量和定量检测心肌蛋白S-亚硝基化水平。结果表明,与模型组相比,参麦方给药组血清损伤指标CK、LDH均明显下降;与假手术组和模型组相比,参麦方给药组血清NO含量显著升高,心肌组织eNOS表达上调,心肌蛋白S-亚硝基化水平由4.42+0.60 nmol·mg-1上升至8.78±1.37nmol·mg-1,以及在90-117 kD分子量范围发生S-亚硝基化的心肌蛋白明显增多,说明参麦方可能通过促进蛋白S-亚硝基化而发挥心肌保护作用。本研究首次运用蛋白质组学方法对大鼠心肌可能发生S-亚硝基修饰的蛋白质进行了较为全面的分析,共发现22个S-亚硝基修饰靶点,且S-亚硝基化修饰可能是一种新的AK活性的调节机制,并发现参麦方抗心肌缺血/再灌注损伤的作用可能与提高心肌蛋白S-亚硝基化修饰水平有关。
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标签：蛋白质巯基亚硝化修饰论文; 硝酸甘油论文; 心肌缺血再灌注损伤论文; 参麦方论文; 蛋白质组学论文;