论文摘要
目的研究microRNA-200c与Zeb1构成的双向负反馈调节通道对眼内恶性肿瘤细胞上皮间质转化（EMT）、成瘤能力及迁徙转移能力的调控作用。方法1) miR-200c对眼内肿瘤上皮间质转化及迁徙能力的调控。①建立miR-200c过表达及表达抑制的细胞模型。应用miR-200c的模拟物和抑制剂对人眼脉络膜黑色素瘤细胞株OCM-1、人视网膜母细胞瘤细胞株WERI-RB1和Y79进行瞬时转染,在三个细胞株中建立miR-200c过表达及表达抑制的细胞模型。通过对miR-2O0c载体所携带的FAM荧光对转染后的细胞内的荧光表达情况进行荧光显微镜下的肉眼观察,初步评估转染效率。应用实时定量PCR对转染前后各株细胞中miR-200c的表达水平进行检测进一步评估转染效率。②miR-200c对其靶基因——上皮间质转化过程的重要转录因子Zeb1的调节作用。使用实时定量PCR、免疫印迹法及免疫荧光等分子生物学检测方法对OCM-1、WERI-RB1和Y79细胞miR-200c转染前后细胞内的Zeb1因子在mRNA和蛋白水平的表达进行检测,以验证miR-200c在眼内肿瘤对Zebl的调控作用。③miR-200c对眼内肿瘤细胞上皮-间质转化的调控。使用实时定量PCR、免疫印迹法及免疫荧光等分子生物学检测方法,对三个细胞株miR-200c转染前后细胞内上皮标记因子E-cadherin、间质标记因子Vimentin和N-cadherin分别进行不同表达水平的定性、定量和定位,以检验miR-200c对上皮-间质转化因子的调控作用。④miR-200c对眼内肿瘤细胞体外迁徙能力的调控。利用Transwell小室对OCM-1和Y79细胞各组（未转染组、空白对照转染组、模拟物WERI-RB1转染组、抑制剂转染组）进行体外透膜迁徙能力检测,以评估的表达干扰对眼内肿瘤细胞运动能力的作用。miR-200c对眼内肿瘤细胞的干细胞标记物Bmi-1的表达及2) miR-200c成瘤性的作用。①应用实时定量PCR和免疫印迹法分别对OCM-1、WERI-RB1和Y79细胞株的未转染组,miR-200c模拟物转染组和miR-200c制剂转染组细胞中的干细胞因子Bmi-1分别进行mRNA及蛋白水平的定量检测,以验证miR-200c对Bmi-1的调控作用。②miR-200的表达干扰对OCM-1细胞的体外成瘤性的调节作用。对OCM-1细胞各转染组进行平板克隆实验以检测细胞的体外成瘤率。3)Zebl对niR-200c及的反馈调节及对OCM-1细胞的作用。①Zeb1过表达稳定株OCM-1细胞的筛选。应用Zeb1过表达慢病毒对OCM-1细胞进行转染,利用慢病毒载体携带的嘌呤霉素抗性基因应用嘌呤霉素对转染后OCM-1细胞进行稳定株筛选。应用梯度浓度的嘌呤霉素作用于正常OCM-1细胞,以72小时接近100%致死率的最低浓度为筛选浓度对转染后的OCM-1细胞进行抗性稳定株筛选,以得到Zeb1过表达稳定株。②通过RT-PCR及Western-blot对过表达组细胞及对照组细胞的Zebl进行RNA水平及蛋白水平定量,以评估转染效率。③通过对miR-200c、E-cadherin、Vimentin、N-cadhern、 Bmi-1的实时定量PCR及WB检测以验证Zeb1对miR-200c的反馈调节及对上皮-间质转化和干性因子的调节作用。④对筛选后稳定株细胞进行培养和形态观察。结果1)①成功在眼内肿瘤细胞株OCM-1、WERI-RB1和Y79中建立miR-200c过表达及表达抑制细胞模型。转染6小时后,荧光显微镜下肉眼观察各个转染组FAM荧光表达率均在80%以上。RT-PCR检测：miR-200c模拟物转染组的细胞中miR-200c的相对表达量较对照组显著增高（p<0.05）,而miR-200c抑制剂转染组的细胞中miR-200c的相对表达量则较对照组显著降低（p<0.05）,差异有统计学意义。②三个细胞株的RT-PCR、Western-blot和免疫荧光的结果均显示miR-200c的过表达能够抑制细胞内EMT启动因子Zeb1表达,而miR-200c的表达抑制则使Zeb1的表达增强。mRNA的相对表达量均与对照组差异显著（p<0.05）,有统计学意义③RT-PCR检测显示上皮标记因子E-cadherin的mRNA相对表达量在miR-200c模拟物组显著增强（p<0.05）,而在抑制剂组则显著降低（p<0.05）,差异有统计学意义。蛋白水平的检测显示：模拟物组蛋白E-cadherin的表达量增强而间质标记蛋白Vimentin和N-cadherin表达减弱。抑制剂组呈现相反改变。④miR-200c的过表达能够降低OCM-1、WERI-RB1和Y79细胞的体外透膜迁徙力,透膜细胞计数与对照组差异显著（p<0.05）,对miR-200c的表达抑制则使肿瘤细胞的迁移能力显著增强,透膜细胞计数与对照组差异显著（p<0.05）。2)①RT-PCR和Western-blot结果显示miR-200c模拟物转染能够抑制三株眼内肿瘤细胞内干性因子Bmi-1在mRNA和蛋白水平的表达,抑制剂转染则上调了Bmi-1的表达,mRNA的相对表达量与对照组差异显著（p<0.05）。②应用OCM-1细胞进行的平板克隆实验也显示过表达miR-200c能够降低其体外成瘤率,而抑制表达则增强其成瘤率。空白对照组,模拟物转染组和抑制剂转染组的成瘤率分别为31.6%,22.8%和57.9%。③对平板克隆实验中各组OCM-1细胞集落的观察发现niR-200c的瞬时转染干预已经可以使体外培养的OCM-1细胞发生一定程度表型的变化的趋势。模拟物转染组的出现部分上皮细胞样生长状态及细胞形态；抑制剂转染则使OCM-1细胞出现一定程度的间质样生长状态和细胞长梭形改变。3)①应用浓度为1.25μg/ml嘌呤霉素对慢病毒转染后的OCM-1细胞进行抗性筛选后得到稳定转染细胞株。RT-PCR检测显示过表达转染组的Zeb1相对表达量为对照组的6.49倍,差异有统计学意义（p<0.05）。WB的检测也显示Zeb1过表达组的Zeb1蛋白定量较对照组增加。②Zeb1对miR-200c存在负反馈作用,二者形成负反馈循环。Zeb1过表达慢病毒转染能使OCM-1细胞中miR-200c的表达显著降低近67%,（p<0.05）,差异有统计学意义。③Zebl的过表达抑制OCM-1细胞的上皮因子E-cadherin的表达,而使间质标记Vimentin、N-cadherin及干性因子Bmi-1的表达显著上调。各指标转染组与对照组差异显著性均有统计学意义（p<0.05）。WB检测结果显示蛋白水平表达变化与RNA水平相一致。④通过稳定株培养过程中的观察发现细胞发生了显著的细胞形态改变,细胞完全变成间质细胞,并出现树突样改变及细胞核的增大。稳定株的功能尚需后续的分子生物学及动物实验来检测。结论miR-200c与Zebl形成了的双向抑制的负反馈环,对眼内肿瘤的上皮-间质转化,成瘤性和迁徙能力起着重要的调节作用。OCM-1细胞的Zebl过表达稳定株出现的显著的间质型表型改变无法完全用EMT引起的细胞骨架改变来解释,这种改变的发生可能合并有除EMT外的其他机制。这种改变的机制其对于肿瘤发展的意义尚需进一步的实验来验证。