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稳定表达猪CD163蛋白的HEK-293细胞系的建立和鉴定

2020-12-14阅读(1005)

稳定表达猪CD163蛋白的HEK-293细胞系的建立和鉴定

论文摘要

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）,给世界养猪业造成了巨大的经济损失,其免疫机理非常复杂,并能利用多种策略逃避机体的免疫应答,现阶段还缺乏切实有效的防治手段。病毒受体是被病毒利用的宿主细胞表面分子复合物,它们能介导病毒顺利进入胞内。研究病毒受体能够更深层次的揭示病毒与宿主细胞的相互作用机制,从而为制定有效的病毒防制措施提供新的思路。猪肺泡巨噬细胞（PAM）是猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）入侵猪体的靶细胞,已发现在PAM上存在三种主要的PRRSV细胞受体：硫酸乙酰肝素（HS）、唾液酸粘附素（Sn）、CD163分子。HS的作用是吸附PRRSV到细胞表面,Sn可以加强吸附作用并介导PRRSV内吞进入胞内,CD163则是随PRRSV一同进入胞内介导病毒的脱衣壳和病毒基因组的释放。近年研究发现,将CD163分子转染进入PRRSV非允许细胞,该细胞稳定表达CD163蛋白后就能够成功感染增殖PRRSV,成为PRRSV允许细胞。鉴于此,本研究从PAM细胞中克隆了猪CD163基因,构建真核表达质粒pCDNA3.1/V5-pCD163,将其转染进入HEK-293细胞,用G418加压筛选,构建稳定表达CD163蛋白的HEK-293-pCD163细胞系。主要研究内容包括以下几个方面：1.猪CD163基因的克隆、序列分析及真核表达质粒pCDNA3.1/V5-pCD163的构建根据GenBank上报道的猪CD163基因序列（EU016226.1）设计引物pCD163-F和pCD163-R,以提取的PAM细胞总RNA为模板,RT-PCR扩增得到猪CD163完整编码区cDNA序列,并将其克隆至pGEM-T easy载体。测序结果显示,克隆得到的序列全长3348bp,编码1115个氨基酸,该序列与GenBank中的参考序列同源性高达99.7%,关键作用区域SRCR5结构域氨基酸序列同源性为100%。在证实序列正确后用BamHI和Xhol酶切连接到真核表达载体pCDNA3.1/V5-His B上,构建真核表达质粒pCDNA3.1/V5-pCD163。2.稳定表达猪CD163蛋白的HEK-293-pCD163细胞系的建立将获得的表达猪CD163蛋白的真核表达质粒pCDNA3.1/V5-pCD163,转染HEK-293细胞,用G418筛选获得稳定表达猪CD163蛋白的293细胞系。并采用RT-PCR、免疫荧光和Western Blot方法证实了猪CD163蛋白在所构建的细胞系中的稳定表达。3.稳定表达猪CD163蛋白的（?）IEK-293-pCD163细胞系感染PRRSV的鉴定用PRRSV WUH3毒株感染建立的HEK-293细胞系,可观察到明显的细胞病变,并主要表现为细胞聚集、圆缩、细胞间出现空洞,最后细胞脱落、裂解。RT-PCR扩增可获得PRRSV的特异性基因、免疫荧光和Western Blot均可检测到病毒蛋白的表达,而未转染猪CD163的HEK-293阴性细胞检测均为阴性,说明构建的细胞系确实能感染PRRSV,并允许PRRSV在其内增殖。4. PRRSV感染]HEK-293-pCD163细胞系和Marc-145细胞的增殖曲线测定和比较用相同剂量的PRRSV WUH3感染HEK-293-pCD163细胞系和Marc-145细胞系,于感染后不同时间收样,测定TCIDso,并绘制增殖曲线。PRRSV WUH3株在两种细胞中的增殖曲线非常相似,但病毒在HEK-293-pCD163中的增殖滴度略高于其在Marc-145细胞中的增殖滴度,进一步证实了所构建的细胞系用于PRRSV增殖的可靠性,从而也为深入开展PRRSV研究提供了新的工具。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 缩略语表
  • 第1章 文献综述
  • 1.1 猪繁殖与呼吸综合征简介
  • 1.1.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒分子生物学与免疫学研究进展
  • 1.1.2 猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞受体研究进展
  • 1.2 CD163分子
  • 1.2.1 CD163的结构、功能和表达分布
  • 1.2.2 构建表达CD163蛋白的细胞系研究进展
  • 1.2.3 CD163与猪繁殖与呼吸综合征病毒相互作用的结构域研究进展
  • 第2章 研究目的和意义
  • 第3章 材料和方法
  • 3.1 试验材料
  • 3.1.1 细胞、毒株与菌株
  • 3.1.2 质粒与载体
  • 3.1.3 工具酶及主要试剂
  • 3.1.4 培养基与抗生素及其配制
  • 3.1.5 抗体
  • 3.1.6 主要缓冲液与相关试剂及其配制
  • 3.2 试验方法
  • 3.2.1 猪CD163基因的克隆
  • 3.2.2 稳定表达猪CD163蛋白的HEK-293细胞系的构建
  • 3.2.3 PRRSV感染稳定表达猪CD163蛋白HEK-293细胞系的验证实验
  • 第4章 结果与分析
  • 4.1 猪CD163基因的克隆和序列分析
  • 4.1.1 猪CD163基因的克隆
  • 4.1.2 猪CD163基因的序列分析
  • 4.1.3 真核表达质粒pCDNA3.1/V5-pCD163的构建
  • 4.2 稳定表达猪CD163蛋白的HEK-293细胞系的建立和鉴定
  • 4.2.1 RT-PCR检测HEK-293-pCD163细胞系猪CD163基因的转录
  • 4.2.2 免疫荧光检测HEK-293-pCD163细胞系猪CD163蛋白的表达
  • 4.2.3 HEK-293-pCD163细胞系表达猪CD163蛋白的Western Blot分析
  • 4.3 PRRSV成功感染HEK-293-pCD163细胞系的验证实验
  • 4.3.1 RT-PCR检测证实PRRSV能感染HEK-293-pCD163细胞系
  • 4.3.2 免疫荧光检测PRRSV在HEK-293-pCD163细胞系中的增殖
  • 4.3.3 PRRSV感染HEK-293-pCD163细胞系的Western Blot分析
  • 4.4 HEK-293-pCD163细胞系感染PRRSV后的细胞病变分析
  • 4.5 HEK-293-pCD163细胞系中PRRSV增殖曲线的测定
  • 第5章 讨论与结论
  • 5.1 讨论
  • 5.2 结论
  • 参考文献
  • 致谢

    • 相关论文文献

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