CD226分子与肿瘤和实验性自身免疫性脑脊髓炎关系的研究

论文摘要

免疫球蛋白超家族（immunoglobulin superfamily,IgSF）成员CD226分子是一种广泛表达于多种免疫细胞膜表面的Ⅰ型跨膜糖蛋白,在2000年第七届国际人类白细胞分化抗原协作组大会上获得新的CD命名。此前,该分子被称为“T细胞谱系特异性活化抗原1（T lineage- specific activation antigen 1,TLiSA1）”、“血小板与T细胞活化抗原1（platelet and T cell activation antigen 1,PTA1）”和“DNAX辅助分子1（DNAX accessory molecule-1,DNAM-1）”。人CD226基因于1996年克隆成功,位于染色体18q22.3,其cDNA全长2664bp,开放读框编码336个氨基酸,其基因存在单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）。小鼠CD226基因由我室于2002年成功克隆,位于染色体18 E4,除了cDNA全长为2487bp的原型分子以外,还存在三种异型。完整的CD226分子由胞膜外区、跨膜区和胞浆区组成,分子量为6567 kDa,胞膜外区有2个IgSF V样结构域和潜在的糖基化位点,胞浆区有磷酸化及与信号分子相互作用的位点。不同种属的CD226分子在核苷酸水平和氨基酸水平均高度同源,蛋白结构也十分相似,是一个在进化上是一个相对保守的分子,提示该分子在机体免疫应答过程和其他生物学功能中可能扮演了极为重要的角色。此外,CD226分子与CD96以及其他Nectin和Nectin样分子（Nectin-like molecule,Necl）有较高的同源性。CD226广泛表达于T细胞、NK细胞、NK T细胞、活化的血管内皮细胞、巨核/血小板谱系、单核细胞、胸腺细胞、某些B细胞亚群、部分造血干细胞和肥大细胞等免疫细胞表面,在免疫系统以外则分布于海马和小脑皮质的神经突触部位。2003年,人CD226的两种配体鉴定成功,分别是CD112/Nectin-2和CD155/Necl-5/PVR（脊髓灰质炎病毒受体）。CD226与其配体的相互作用参与CTL和NK细胞的活化、分化和细胞毒作用,调节CD4+ T细胞的增殖和分化,介导内皮细胞与其他细胞的黏附,促进血小板的活化与聚集,参与造血调控,介导肥大细胞的脱颗粒作用,参与NK T细胞和胸腺细胞的抗凋亡作用、树突状细胞的成熟、免疫突触和神经突触的形成,并与肿瘤、自身免疫性疾病、移植排斥及病毒感染等疾病密切相关。人CD226除以膜型（mCD226）的形式表达在细胞膜表面外,还以可溶型（sCD226）的形式存在于血清和细胞培养上清中。前期小规模临床标本检测发现,在肿瘤和多种自身免疫性疾病患者的血清中,sCD226的水平均显著高于正常人,但是目前关于CD226与临床疾病的研究仅限于膜型和/或可溶型CD226的表达及其基因SNP与疾病的关系,而CD226在肿瘤及自身免疫性疾病中的作用和可能的分子机制尚不清楚。本研究首先制备和鉴定了一批抗人IgG Fc段、谷胱甘肽-S-转移酶（glutathione-S-transferase,GST）、麦芽糖结合蛋白（maltose-binding protein,MBP）和硫氧化还原蛋白（thioredoxin,Trx）等常用标签蛋白（tag）的单克隆抗体（monoclonal antibody,mAb）,在此基础上建立或改良了定量检测GST、Fc、MBP和Trx或其融合蛋白的双抗体夹心ELISA试剂盒,敏感性分别达到了1.2、15.6、1和0.4 ng/ml。应用Fc ELISA试剂盒检测上清中hCD226-Fc水平的方法,克隆化了高水平分泌该融合蛋白的CHO-hCD226-Fc细胞株,大量制备细胞培养上清,并用抗Fc mAb标记的Sepharose 4B亲和层析柱纯化了hCD226-Fc融合蛋白,用SDS-PAGE、Western blot和流式细胞术（flow cytometry,FCM）鉴定其纯度和生物学活性,以此作为人sCD226 ELISA试剂盒的标准品以及体外杀伤实验中模拟天然sCD226作用的试剂。另外,还对我室前期研制的定量检测人sCD226的双抗体夹心ELISA试剂盒进行了改良。应用条件优化后的ELISA试剂盒检测了259例肿瘤患者（包括消化、呼吸、血液、妇科、骨骼、神经系统等多种来源的肿瘤）及129例正常人血清中sCD226的水平,发现肿瘤患者血清中sCD226的水平（0.2-60 ng/ml,中位数11.5 ng/ml）明显高于正常人（0.1-23 ng/ml,中位数6.3 ng/ml,P<0.001）;而在用FCM检测外周血单个核细胞（peripheral blood monouclear cell,PBMC）上mCD226的表达时,发现肿瘤患者PBMC上mCD226的表达（14例,1.1%-56.1%,中位数17.45%）明显低于正常人（12例,43.1%-77.8%,中位数65.3%,P<0.001）。在体外NK细胞杀伤肿瘤细胞的模型中用重组表达的可溶型hCD226-Fc融合蛋白模拟天然sCD226的作用,发现hCD226-Fc能显著抑制NK细胞对其靶细胞K562细胞的杀伤,浓度为1μg/ml时抑制率即可达到34%,而且这种抑制作用呈剂量依赖性。在佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA）活化的正常人PBMC和Jurkat细胞上,3种蛋白酶抑制剂（金属蛋白酶抑制剂1-10-phenanathroline、丝氨酸蛋白酶抑制剂AEBSF和半胱氨酸蛋白酶抑制剂NEM）可以在上调mCD226的表达的同时下调培养上清中sCD226的水平,由于多种蛋白酶在许多肿瘤中含量可能有所增加,提示蛋白酶解作用可能是肿瘤患者血清中sCD226的形成机制。用免疫沉淀和Western blot的方法鉴定了血清和细胞培养上清中sCD226的分子量,发现在肿瘤患者和正常人血清以及PMA刺激的PBMC和Jurkat细胞培养上清中,均存在50 kDa的特异性条带,这与CD226分子的胞膜外区分子量相符。另外,血清样本中还存在一个45 kDa的条带,这一条带在PMA刺激的细胞培养上清中不存在,提示不同蛋白酶对CD226的酶解作用可能发生在该分子胞膜外区的不同位置。在搞清了肿瘤患者sCD226的表达、作用和来源的基础上,我们提出了如下假说:肿瘤患者中升高的蛋白酶可能通过酶解作用导致了PBMC上mCD226表达下调而血清中sCD226的水平上调,高水平的sCD226与其膜型配体CD112/CD155分子相结合,减弱了杀伤细胞上mCD226分子与肿瘤细胞表面膜型CD112/CD155的结合,从而抑制了杀伤细胞活化信号的产生,并最终导致肿瘤细胞发生免疫逃逸。本研究还用ELISA和胞内细胞因子染色的方法观察了抗人CD226的mAb LeoA1对混合淋巴细胞培养（mixed lymphocyte culture,MLC）和PBMC中细胞因子分泌格局及细胞亚群百分比的调控,发现被上调的有IL-10、GM-CSF和G-CSF等,被下调的有IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-12 p40、IL-15、IL-23和TGF-α等,相关的细胞亚群包括Th1、Th2、CTL、NK以及单核/巨噬和DC。采用信号分子阻断剂的手段,分析了CD226调控MLC细胞因子分泌格局的信号通路中可能涉及的信号分子主要有p38、JNK和PI3K。最后,成功建立了小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE）模型,证实了抗CD226抗体对EAE的发生有明显的防治作用,其分子机制涉及中枢神经系统局部炎细胞浸润的减轻,脾脏CD25阳性的活化细胞数量的减少,以及脾脏IL-10+细胞和调节性T细胞百分率的增加。简言之,本研究的实验结果为阐明CD226分子在肿瘤和自身免疫性疾病中的作用提供了实验依据,并为深入研究CD226参与机体多种生理功能和病理过程的分子机制奠定了基础。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 文献回顾
• 一、CD226 分子及其配体
• 1. CD226 的发现与命名
• 2. CD226 的基因与结构
• 2.1 人CD226 的基因
• 2.2 hCD226 的结构
• 2.3 其他种属的CD226 分子
• 3. CD226 的表达分布与存在形式
• 3.1 表达分布
• 3.2 存在形式
• 4. CD226 的配体及相关分子
• 4.1 配体
• 4.2 相关分子
• 二、CD226 分子的功能
• 1. CTL和NK细胞的活化、分化和细胞毒作用
• + T细胞的增殖和分化'>2. CD4⁺T细胞的增殖和分化
• 3. 内皮细胞与其他细胞的黏附
• 4. 其他细胞
• 4.1 血小板
• 4.2 造血干/祖细胞
• 4.3 肥大细胞
• 4.4 胸腺细胞
• 4.5 CNS
• 三、CD226 分子与临床疾病
• 1. CD226 与肿瘤
• 2. CD226 与自身免疫性疾病
• 2.1 多发性硬化症及其动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎
• 2.2 其他自身免疫性疾病
• 3. CD226 分子与其他疾病
• 3.1 移植排斥反应
• 3.2 病毒感染性疾病
• 正文
• 实验一定量检测人可溶型CD226 分子双抗体夹心ELISA试剂盒的制备和条件优化
• 1 材料
• 1.1 动物与细胞
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器
• 2 方法
• 2.1 mAb的制备、纯化及鉴定
• 2.2 定量检测标签蛋白及含标签的融合蛋白的夹心ELISA的建立
• 2.3 克隆化建立稳定分泌hCD226-Fc融合蛋白的CHO-hCD226-Fc细胞株
• 2.4 hCD226-Fc融合蛋白的大量制备、纯化及鉴定
• 2.5 双抗体夹心ELISA试剂盒的条件优化
• 3 结果
• 3.1 标签蛋白mAb的制备、鉴定及相应夹心ELISA试剂盒的建立
• 3.2 hCD226-Fc融合蛋白的大量制备、纯化及鉴定
• 3.3 sCD226 夹心ELISA试剂盒的条件优化
• 4 讨论
• 实验二 可溶型CD226 分子在肿瘤中的表达、功能及其产生机制的研究
• 1 材料
• 1.1 检测标本与细胞
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器
• 2 方法
• 2.1 肿瘤患者及正常人血清中sCD226 的检测
• 2.2 肿瘤患者及正常人PBMC上mCD226 的检测
• 2.3 hCD226-Fc融合蛋白体外干预NK细胞对其靶细胞的杀伤
• 2.4 蛋白酶抑制剂对mCD226 及sCD226 的调节
• 2.5 sCD226 分子量的鉴定
• 2.6 统计学分析
• 3 结果
• 3.1 肿瘤患者血清中sCD226 水平上调而PBMC上mCD226 表达下调
• 3.2 hCD226-Fc融合蛋白体外抑制NK细胞对其靶细胞的杀伤
• 3.3 蛋白酶抑制剂上调mCD226 而下调sCD226
• 3.4 血清及细胞培养上清中sCD226 的分子量的鉴定
• 4 讨论
• 实验三 人CD226 分子调控MLC和PBMC细胞因子分泌格局的研究
• 1 材料
• 1.1 细胞
• 1.2 试剂和服务
• 2 方法
• 2.1 MLC的建立
• 2.2 培养上清中细胞因子的检测
• 2.3 胞内细胞因子染色
• 2.4 信号分子阻断剂对CD226 mAb调控细胞因子分泌的影响
• 3 结果
• 3.1 CD226 mAb调控MLC和PBMC培养上清中细胞因子的分泌
• 3.2 CD226 mAb调控MLC中细胞亚群
• 3.3 信号分子阻断剂对LeoA1 调控MLC细胞因子分泌的影响
• 4 讨论
• 实验四小鼠CD226 分子与EAE关系的初步研究
• 1 材料
• 1.1 动物
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器
• 2 方法
• 2.1 EAE模型的建立和评分
• 2.2 小鼠CNS组织的取材和免疫荧光或HE染色
• 2.3 小鼠脾细胞的分离、体外刺激及FCM分析
• 3 结果
• 3.1 EAE模型的成功建立
• 3.2 CD226 与EAE小鼠CNS炎细胞浸润的关系
• + T细胞各亚群表型和功能的体内外调控'>3.3 CD226 对EAE小鼠CD4⁺T细胞各亚群表型和功能的体内外调控
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢