三类新型集成化的基因芯片及其相关仪器的研制

论文摘要

基因芯片技术是一种高通量的现代生物检测技术,在功能基因研究、新药筛选、疾病的基因诊断等领域具有广泛的应用。基因芯片检测是一个复杂的过程,包括:靶基因的扩增、扩增产物的标记、芯片杂交与清洗、杂交信号检测及分析等。在这样的一个复杂检测流程中,容易产生由于操作过程的复杂性而带来的检测结果不稳定,从而影响了基因芯片的推广应用。我们研制基因扩增杂交一体化检测仪的目的是为了实现从基因扩增、荧光标记、杂交与清洗、芯片信号检测的一系列流程的自动化操作,以减少检测结果的人为因素的干扰,提高基因芯片在基因多态性分析及疾病诊断等方面的应用水平。为了进一步简化基因扩增杂交检测一体化芯片结构及其仪器的复杂性,我们又提出了管盖基因芯片。为能够对多个靶基因实现定量检测,我们在本实验室提出的TaqMan微阵列芯片的基础上,设计和研制了定量基因芯片检测系统,并设计了一种新的FRET定量检测基因芯片,可用于同一样品中不同基因的高通量定量检测。1.基因扩增杂交一体化芯片及检测系统针对基因芯片检测过程的复杂性,我们设计了集成化的操作平台—基因扩增杂交检测一体化芯片,用于实现基因扩增、杂交、清洗、检测的自动化以减少复杂操作过程中的人为因素影响。基因扩增杂交检测一体化芯片的结构包括二个功能区域:十四个通道的玻璃毛细管作为基因扩增区域和由十四个在玻片上固定了核酸探针阵列的基因芯片组成的杂交检测区。使用了硅胶作为密封件,分别将二个区域相连。该芯片可实现十四个通道的基因扩增与基因芯片检测一体化,检测样品流程所需要的时间为3~4小时。基于上述生物芯片,我们设计和研制了基因扩增杂交一体化检测仪,能够进行PCR、生物芯片杂交和荧光检测的一体化操作。基因扩增杂交一体化检测仪主要由温度精确控制系统、样品自动注入系统和荧光检测几部分组成,包括:计算机、加热炉、荧光显微镜、温度控制器、试样装夹及送进机构、运动控制箱、清洗机构等。与南京依科机电有限公司合作开发出相应的产品,通过了江苏省医疗器械检测所的检验,建立了医疗器械注册产品标准。该仪器有如下的结构特点:(1)利用蠕动泵,电磁开关等进行液体的控制。通过软件控制,实现了反应体系在基因扩增区域与杂交区域的密封与流动。通过液体的输送,实现了基因扩增产物与杂交液的混合及与芯片的杂交反应。(2)杂交过程的温度控制通过空气介导的温控体系来实现。具有变温快、温度场均匀等优点。此仪器能够对PCR反应区的温度进行精确控制,其温度上升的速率可达到20 oC/s,下降的速率可达到10oC/s。(3)芯片的荧光杂交信号检测是通过荧光显微镜与CCD的图像采集技术实现的。芯片被固定在二维移动平台上在显微镜下进行荧光信号的扫描阅读,在PC机上显示,存入计算机。基于上述芯片和仪器,我们发展了用于乙型肝炎基因突变检测的试剂,可以对乙型肝炎YMDD突变基因进行检测,并在南京市第二医院进行了临床检测,检测准确率达到100%。通过与在普通

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要（Abstract）
• 第一章 绪论
• 1.1 生物芯片的发展现状
• 1.1.1 生物芯片的简介
• 1.1.2 基因芯片
• 1.1.3 蛋白质芯片
• 1.1.4 细胞芯片
• 1.1.5 组织芯片
• 1.2 基因芯片制备方法
• 1.3 生物芯片技术应用
• 1.3.1 表达基因芯片
• 1.3.2 SNP 基因芯片
• 1.3.3 遗传性疾病检测型基因芯片
• 1.3.4 基因分型检测基因芯片
• 1.3.5 病原体检测基因芯片
• 1.3.6 微流体生物芯片
• 1.4 基因芯片检测仪
• 1.5 本研究的意义和目的
• 1.5.1 本研究的意义
• 1.5.2 本研究的目的
• 1.6 本文的主要内容和结构
• 1.6.1 本文主要内容
• 1.6.2 本文的结构
• 第二章 基因扩增杂交荧光检测一体化仪的研制
• 2.1 引言
• 2.2 基因扩增杂交检测一体基因芯片
• 2.2.1 基因扩增杂交一体芯片结构
• 2.2.2 基因扩增杂交一体芯片功能实现过程
• 2.3 仪器系统
• 2.3.1 进给机构
• 2.3.2 基因扩增与杂交温度控制系统硬件设计
• 2.3.3 基因扩增杂交一体芯片的杂交与清洗液体控制系统
• 2.3.4 基因扩增杂交一体芯片的检测系统
• 2.4 软件系统
• 2.4.1 温度控制系统
• 2.4.2 温度系统的可靠性设计与测量系统的精度
• 2.5 液体控制
• 2.6 扫描平台研究
• 2.7 小结
• 第三章 乙肝病毒基因突变检测基因芯片研究
• 3.1 引言
• 3.2 乙肝病毒突变检测基因扩增杂交检测一体芯片
• 3.2.1 基因扩增杂交检测一体化芯片的设计
• 3.2.2 检测引物与探针的设计
• 3.2.3 基因扩增杂交检测一体化芯片制备
• 3.2.4 样本制备
• 3.2.5 检测过程
• 3.2.6 检测结果
• 3.2.7 小结
• 3.3 乙肝病毒突变检测分子信标芯片
• 3.3.1 分子信标探针的设计
• 3.3.2 分子信标用于核酸定量检测
• 3.3.3 分子信标用于YMDD 突变的基因芯片检测
• 3.3.4 分子信标基因芯片的突变检测
• 3.4 小结
• 第四章 管盖基因芯片
• 4.1 基因芯片
• 4.2 管盖基因芯片结构
• 4.3 管盖基因芯片加工
• 4.3.1 管盖加工
• 4.3.2 杂交缓冲液贮液池加工
• 4.3.3 Eppendorf 管的管体加工
• 4.4 点样支架加工
• 4.5 检测支架的加工
• 4.6 小结
• 4.6.1 管盖基因芯片的结构
• 4.6.2 简单的制造工艺
• 4.6.3 防止交叉污染
• 第五章 管盖基因芯片探针固定方法的研究
• 5.1 管盖表面处理
• 5.1.1 管盖表面处理
• 5.1.2 等离子处理材料与方法
• 5.1.3 表面性质的表征
• 5.1.4 表面等离子处理正交分析
• 5.1.5 探针固定
• 5.2 管盖表面亲水膜固定
• 5.2.1 聚丙烯酰胺凝胶薄膜的固定及表面处理
• 5.2.2 琼脂糖凝胶薄膜的固定及表面活化
• 5.2.3 亲水薄膜的探针固定及检测
• 5.2.4 管盖结构选择
• 5.3 管盖基因芯片信号强度
• 5.4 小结
• 第六章 管盖基因芯片检测仪研制
• 6.1 背景
• 6.2 管盖芯片及其检测方案
• 6.2.1 检测系统框架
• 6.2.2 管盖基因芯片检测系统的结构
• 6.3 管盖基因芯片分析系统（GAS）
• 6.3.1 图像矫正
• 6.3.2 图像预处理
• 6.3.3 半自动匹配
• 6.3.4 杂交强度计算
• 6.3.5 有效性验证
• 6.4 管盖基因芯片系统
• 6.5 小结
• 第七章 SARS 管盖基因研究
• 7.1 序言
• 7.2 十种呼吸道病毒检测管盖基因芯片研究
• 7.2.1 核酸探针与引物的设计
• 7.2.2 样品纯化方法
• 7.2.3 最佳RT-PCR 反应循条件与最适反应体系配比的建立
• 7.2.4 人工合成的寡核苷酸的选择、优化及其最佳点样浓度的选择
• 7.2.5 呼吸道九种病毒检测管盖基因芯片制备
• 7.3 九种病毒的检测结果
• 7.3.1 检测结果
• 7.3.2 图像处理
• 7.3.3 杂交信号判定
• 7.3.4 分子信标用于管盖基因芯片检测与普通核酸探针对照
• 7.4 SARS 冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、肠病毒核酸荧光检测试剂盒的研制
• 7.4.1 制造检测规程
• 7.4.2 试剂盒实际样品检测
• 7.4.3 试剂盒实际样品结果
• 7.4.4 质量控制
• 7.5 小结
• 第八章 HIV 管盖基因芯片的研究
• 8.1 引言
• 8.1.1 HIV 药物治疗
• 8.1.2 HIV 耐药性的产生
• 8.1.3 HIV 耐药性基因突变及相关检测
• 8.2 材料与方法
• 8.2.1 管盖基因芯片制备
• 8.2.2 引物及探针设计
• 8.2.3 HIV-1 主要药物相关基因突变检测管盖基因芯片的制备
• 8.2.4 基因扩增检测操作过程
• 8.3 检测结果
• 8.3.1 标准样品检测
• 8.3.2 实际样的检测
• 8.4 小结
• 第九章 基因芯片定量检测仪及定量基因芯片的研制
• 9.1 引言
• 9.2 系统研制
• 9.2.1 检测系统框架
• 9.2.2 光学平台
• 9.2.3 三维基因芯片扫描平台
• 9.2.4 数字信号采集系统
• 9.2.5 温度控制系统
• 9.2.6 仪器整体结构
• 9.2.7 软件框架
• 9.3 技术指标
• 9.4 FRET 定量检测芯片研究
• 9.4.1 FRET 定量检测芯片原理
• 9.4.2 FRET 检测探针的设计及液相定量基因扩增研究
• 9.4.3 FRET 探针微阵列芯片的制备
• 9.4.4 固相基因定量扩增实验研究
• 9.4.5 固相基因定量扩增小结
• 9.5 小结
• 第十章 总结及展望
• 10.1 基因扩增杂交一体化检测仪研究
• 10.2 管盖基因芯片
• 10.3 SARS 相关病毒检测试剂盒
• 10.4 HIV-1 耐药基因突变的检测
• 10.5 定量基因芯片扫描仪及FRET 定量检测基因芯片
• 10.6 进一步工作需要解决的问题及研究展望
• 参考文献
• 发表论文、申请专利及科研成果
• 1 发表论文
• 2 申请专利
• 3 课题研究
• 4 成果鉴定
• 致谢