论文摘要
研究背景及目的随着社会的发展,心血管类疾病已成为威胁人类生命健康和生活质量的头号疾病。心血管疾病共同的病理基础是动脉粥样硬化（Atherosclerosis,As）。对动脉粥样硬化发病机制的研究一直是医药学界研究的重点和热点,到目前为止,对于As的发病机制尚未明确,但As发生的始动因素得到了国内外研究学者的普遍共识,即血管内皮损伤。血管内皮损伤直接导致内皮屏障功能障碍,血管内皮通透性增高,致病因子侵入内皮,诱导As发生和发展。在导致血管内皮屏障功能障碍的因素中,血流切应力具有至关重要的作用。血流切应力已被证明在As斑块发生的局灶性中具有重要作用。在低切应力（<4dyn·cm-2）血流作用下的动脉血管更易于形成斑块,而高切应力（>15dyn·cm-2）对血管具有保护的作用。血管内皮细胞直接感受血流切应力的变化,低切应力作用可以引起细胞骨架重构,导致血管内皮屏障功能的损害,使血液中的脂质等物质更易通过内皮细胞,促进As的形成。F-actin（微丝肌动蛋白）是调节细胞骨架重构的主要收缩蛋白。F-actin重排依赖于肌球蛋白轻链（Myosin Light Chain, MLC）的磷酸化。肌球蛋白轻链激酶（Myosin Light Chain Kinase, MLCK）和ROCK/ROK/Rho激酶（Rho Kinase, ROCK）是调节MLC磷酸化的两种重要激酶。研究证实,血流切应力对成骨细胞的收缩具有Ca2+依赖性（MLCK通路）和非Ca2+依赖性（ROCK通路）两种途径。那么血流切应力对脐动脉内皮细胞骨架重排的作用是否也具有Ca2+依赖性和非Ca2+依赖性还需要研究证实。参莲提取物（SL extract）是在中医临床经验的基础上,结合现代医学较为公认的As病理机制的“损伤—反应学说”和现代药理学研究成果所精选出的防治As有效组方的提取物。本实验室的前期研究结果证实,SL提取物能改善血管内皮功能,对As有很好的防治作用,但其改善内皮功能是否通过抑制内皮细胞骨架的改变或重组而起作用未见相关报道。因此,本课题以研究参莲提取物抑制细胞骨架重构为目的,从诱导细胞骨架重构的关键蛋白——肌球蛋白轻链（MLC）的磷酸化为切入点,重点研究SL提取物对介导MLC磷酸化的两条关键通路：肌球蛋白轻链激酶（MLCK）通路和ROCK激酶信号通路的干预作用,从血流切应力角度分析SL提取物抑制细胞骨架重构的Ca2+依赖性和非Ca2+依赖性效应,探讨SL提取物抑制As发生的作用机制。研究方法和内容1.SL提取物对低切应力介导的兔颈总动脉粥样硬化形成的作用研究首先应用颈总动脉套管法建立局部低切应力兔动脉粥样硬化模型。在模型建立的2周、4周和8周,运用电磁血流量计分别检测套管近心端和对侧的血流量,耳中动脉取血后,应用全自动生化仪检测不同时间点各组动物的全血粘度和血清总胆固醇（’Total Cholesterol, TC）、甘油三酯（Triglyceride, TG）、低密度脂蛋白胆固醇（Low Density Lipoprotein Cholesterol, LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（High Density Lipoprotein Cholesterol, HDL-C）的水平；同时在2周、4周和8周时取血管近心端及对侧相同体位血管,固定后HE染色观察血管病理情况,扫描电镜观察内皮形态变化。2.SL提取物对低切应力诱导的兔颈总动脉粥样硬化形成的机制研究在造模并给药的2周、4周和8周,取颈总动脉套管处的近心端及对侧相同体位的血管,裂解组织后提取蛋白,应用Western blot检测血管组织中肌球蛋白轻链（MLC）和MLC的磷酸化水平p-MLC,检测肌球蛋白轻链激酶（MLCK）和ROCK/ROK/Rho激酶（ROCK）的表达；免疫组织化学法检测不同时间点MLCK蛋白和ROCK蛋白表达水平。3.SL提取物干预切应力介导的人脐动脉内皮细胞钙内流的研究Bioflux1000控剪应力微流通道培养人脐动脉内皮细胞；数控剪切流系统加载不同切应力后进行免疫荧光染色,应用激光共聚焦显微镜实时观察细胞内游离钙变化。在应用MLCK特异性阻断剂ML-7, ROCK特异性阻断剂Y-27632及钙通道阻断剂Nicardipine干预的前提下,加载不同切应力,观察SL提取物对低切应力依赖的钙内流的影响。4.SL提取物对切应力介导的细胞骨架重排的作用机制研究BioFlux1000高通量微流系统培养人脐动脉内皮细胞,加载切应力后,进行免疫荧光染色,应用激光共聚焦显微镜观察细胞骨架的变化,分析F-actin、 MLCK、ROCK、MLC、p-MLC表达的变化。在应用MLCK特异性阻断剂ML-7、ROCK特异性阻断剂Y-27632、钙通道阻断剂Nicardipine干预后,观察SL提取物对切应力介导的F-actin、MLCK、ROCK、MLC、p-MLC表达变化的影响,分析SL提取物的作用机制。研究结果1.低切应力诱导的颈总动脉粥样硬化兔模型复制成功：套管近心端形成局部低切应力,对侧为正常切应力。SL提取物对局部血流具有一定的改善作用,能剂量依赖性的增高血管近心端血流量,明显改善血流切应力；SL提取物能降低As模型兔血脂水平,抑制内膜增厚和斑块的形成；扫描电镜观察结果显示SL提取物对低切应力诱导的血管内皮损伤具有抑制作用。2.SL提取物能时间依赖性的抑制MLCK和ROCK在近心端的表达,对MLC的磷酸化水平也具有明显的抑制作用。MLCK在血管的分布变化随时间的进展具有进行性增高的趋势,前期主要在内膜表达,4周和8周时在中膜和外膜表达较多；ROCK的表达分布主要集中在中膜。3.低切应力可以有效介导HUAEC细胞胞浆游离钙的增高,其作用具有时间依赖性；HUAEC胞内游离钙的增高作用主要与细胞外钙的流入有关；SL提取物可以抑制低切应力诱导的细胞外钙内流。4.低切应力诱导细胞骨架重构的作用与MLC磷酸化水平有关；在低切应力作用下, F-actin、MLCK、ROCK、p-MLC/MLC表达水平增高,SL提取物可以翻转此作用。SL提取物抑制细胞骨架重排的作用主要与Ca2+依赖的MLCK通路有关。结论1.SL提取物抑制细胞骨架重排可能是其干预低切应力介导的血管内皮屏障功能障碍重要机制之一；2.Ca2+依赖性途径可能是SL提取物抑制细胞骨架重构的重要信号途径。